《给排水生化技术》课件-4.4.1 分光光度法

4.4.1分光光度法4.4.1Spectrophotometer分光光度法内容介绍分光光度法基础知识光吸收定律显色反应光度测量条件的选择分光光度法基础知识一、分光光度法的概念概念：分光光度法是以物质对光的选择性吸收为基础的光化学分析方法。既可以进行定性分析，也可以进行定量分析。分光光度法可见分光光度法紫外分光光度法红外分光光度法分光光度法基础知识二、分光光度法的特点方法灵敏度高，测定下限可达10－5～10－6mol/L（0.001%~0.0001%），可用于微量组分测定。准确度高，Er=2%~5%。操作简便快速，仪器设备简单。应用广泛，可用于几乎所有的无机离子和大多数有机物的定性和定量分析。分光光度法基础知识三、物质对光的选择性吸收各种电磁波（光）按其波长或频率大小顺序排列的图表称电磁波谱。光的基本性质波谱名称真空紫外光区近紫外光区可见光区近红外光区中红外光区远红外光区波长范围10~200nm200~400nm400~780nm0.75~2.5μm2.5~50μm50~1000μm能量跃迁中层电子价电子价电子能分子振动分子振动分子转动可见光

可见光表1电磁波谱分光光度法基础知识单色光：具有同一波长（频率）的光称为单色光，可用于分光光度分析。复合光：含有多种波长的光为复合光。互补光：两种适当的不同颜色的光按一定强度比例混合可得到白光，那么这两种颜色的光就称为互补光。光的种类分光光度法基础知识不同颜色的可见光波长及其互补光。/nm颜色互补光400-450紫黄绿450-480蓝黄480-490绿蓝橙490-500蓝绿红500-560绿红紫560-580黄绿紫580-610黄蓝610-650橙绿蓝650-760红蓝绿分光光度法基础知识物质的颜色：是由于不同物质对不同波长的光具有选择性的吸收作用而产生的。即物质对光的吸收具有选择行。实践证明：物质呈现的颜色与其吸收光的颜色互为补色。吸收黄光蓝光光吸收定律一、朗伯-比尔定律一束强度为I0平行单色光垂直照射到透明溶液时，光的一部分被吸收，一部分被器皿的表面反射，一部分透过溶液强度为It。透射比T。光吸收定律又称朗伯-比尔定律，是分光光度法定量分析的依据。吸光度与透射比IoIt一般来说It比Io小，固常用百分数表示透射比。光吸收定律当入射光强度I0一定时，透射光强度It越小，溶液对光的吸收越大，即吸光度A越大。吸光度A与透射比T的关系可以用下式表示：由公式可知，当It=0时，T=0%,表示光全部被溶液吸收，吸光度=∞。当It=I0时，表示光全部透过溶液，溶液对光没有吸收，即吸光度A=0。光吸收定律朗伯-比尔定律的表达朗伯定律A=k1b溶液浓度一定比尔定律A=k2c液层厚度一定朗伯-比尔定律A=Kbc溶液浓度和液层厚度都改变光吸收定律吸光系数K质量吸收系数a、摩尔吸收系数κ摩尔吸收系数与溶液浓度和液层厚度无关，但与物质的性质、入射光的波长、溶剂的种类及温度等因素有关。光吸收定律对朗伯-比尔定律的偏离由朗伯-比尔定律公式可知，当吸收池的厚度一定时，吸光度与溶液的浓度成正比，以吸光度对浓度作图应该一条过原点的直线。实际测定中，吸光度与溶液浓度之间常常偏离线关系，这种现象成为对朗伯-比尔定律的偏移。光吸收定律对朗伯-比尔定律偏离的原因：1.非单色入射引起的偏离非单色光引起的偏离一般为负偏离。为了减少非单色光引起的偏离，应选择吸收曲线上较为平坦的部分对应波长作为入射波长。2.化学因素引起的偏离吸光质点的相互作用，浓度较大时，产生偏差，朗伯-比尔定律只适合于稀溶液

（c<10-2mol·L-1)。平衡效应，物质的离解、缔合、互变异构及化学变化引起的偏离。CA标准工作曲线图正误差负误差显色反应一、显色反应将无色或浅色物质转变为有色物质的反应称为显色反应，所用的试剂称为显色剂。Fe2+在浓度较低时，几乎无色，可以用1,10-邻二氮菲为显色剂与其反应，生成橙红色的1,10-邻二氮菲亚铁配合物。M(待测物)＋nR(显色剂)＝MRn(有色化合物)例如：显色反应二、对显色反应的要求显色反应主要有配位反应和氧化还原反应，其中绝大多数是配位反应。灵敏度高选择κ较大的显色反应（一般要为104~105）。避免共存组分干扰。有色物组成固定。有色物稳定性高，其它离子干扰小。显色过程易于控制，而且有色化合物与显色剂之间的颜色差别应尽可能大。∆λ≥60nm。选择性好，显色剂只与被测组分反应。显色反应三、显色反应条件的选择（实验确定）1.显色剂的用量，适当过量M+R=MRR过量，反应完全，MR稳定，A值稳定。(被测组分）(显色剂)(有色化合物)显色反应2.溶液的酸度（pH）许多显色剂都是有机弱酸或有机弱碱，溶液的酸度会直接影响显色剂定的离解程度，从而影响显色反应完成的程度。对某些能形成逐级配合物的显色反应，产物的组成会随介质酸度的改变而改变，从而影响溶液的颜色。某些金属离子会随着溶液酸度的降低而发生水解，甚至沉淀，使有色配合物离解，从而使显色反应进行不完全。显色反应3.显色温度（T)、显色时间（t）和稳定时间不同的反应对显色的温度和显色的时间都有不同的要求，需要根据具体实验确定适应的显色温度范围和反应温度。有色化合物的稳定程度不同，需要在稳定的时间内进行吸光度的测定，因此也需要通过实验确定稳定时间。T1(℃)T2(℃)t(min)A显色反应4.溶剂显色反应溶剂的选择原则：溶剂不与待测组分反应，对测定波长无明显吸收，对待测组分有较好的溶解能力。有机溶剂会降低有色物的离解度，从而提高显色反应的灵敏度。5.共存离子的干扰干扰离子本身有颜色，影响待测离子的测定。共存离子与显色剂反应生成更稳定的配合物，是测量结果偏低。显色反应共存离子与显色剂反应生成有色化合物或沉淀，使测量结果偏高。干扰的消除方法：加入掩蔽剂、控制酸度使干扰离子不显色、改变干扰离子价态、分离干扰离子、还可选择适当的参比溶液和入射光的波长等方法来消除共存离子的干扰。分光光度法光度测量条件的选择入射光波长的选择吸光度范围的选择参比溶液的作用与选择光度测量条件的选择一、入射光波长的选择根据吸收曲线选择入射光测量波长，遵循以下原则：选择最大吸收波长λmax作为测量波长，称为最大吸收原则，以获得较高的灵敏度。如果λmax处吸收峰太尖，则在满足分析灵敏度前提下，可选用灵敏度稍低的波长作为测量波长，以减少非单色光引起的对朗伯-比尔定律的偏离。在λmax处有干扰时，可以选用无干扰、灵敏度稍低的波长作为测量波长，以消除干扰。光度测量条件的选择二、吸光度范围的选择T=36.8%，即A=0.434时，测量的相对误差1.4%为最小值。T在15%～65%，即A=0.2～0.8时，浓度的相对误差≤±2%，能满足分析测定要求。故A应控制在0.2~0.8范围内。可通过调节待测溶液的浓度或选用不同厚度的吸收池来调整待测溶液的吸光。光度测量条件的选择三、参比溶液的作用及选择在吸光度测量中，作为比较的溶液或溶剂称为参比溶液或空白溶液。1.参比溶液的作用在分光光度分析中，首先要用参比溶液调节透射比T=100%，即A=0，然后再测定待测溶液的吸光度，相当于是以透过参比溶液的光束为入射光。A总＝A试剂＋A显色剂＋A干扰＋A络合物溶剂缓冲剂干扰干扰与显色剂形成络合物被测物与显色剂生成选择参比溶液的总原则是：使试液的吸光度能真正反映待测组分的浓度光度测量条件的选择利用参比溶液来消除因溶剂或器皿对入射光反射和吸收带来的误差。2.参比溶液的选择表2参比溶液的种类试剂显色剂试样中其他组分（即基体）参比溶液无吸收无吸收无吸收溶剂有吸收有吸收无吸收试剂参比或空白参比无吸收无吸收有吸收，但不与显色剂反应不加显色剂的试液有吸收有吸收有吸收掩蔽待测物质或使待测物质的显色化合物褪色的参比溶液溶液浓度的测定原理朗伯—比尔定律（A=κbc）。方法标准曲线法或