【血清肿瘤标志物联合检测在肺癌诊断中的应用价值探究7500字（论文）】

第一章前言IV血清肿瘤标志物联合检测在肺癌诊断中的应用价值研究摘要该项目将搜集河北地区2019-03-2020-03期间的65位肺癌确诊病人。对这一群体进行流行病学调查分析。本次研究共分为两组：一组为郑州市某医院门诊就诊且符合纳入标准的肺外疾病患者；另一组是郑州某院住院接受治疗且符合排除条件的其他非肺病患者共计70例。数据统计分析结果报告如下资料，其中包括32例鳞状细胞癌、24例腺癌和9例小细胞肺癌患者。年龄范围在27-88岁，平均为53.7岁。所有肺癌和良性肺病患者早上都空腹，取静脉血并离心分离血清。应用酶联免疫方法检测血清中肿瘤标志物CYFRA21-1,CEA和CA125的水平。通过对郑州地区不同肿瘤标志物（CYFRA21-1,CEA和CA125）联合检测血清表达水平来探讨其在肺癌临床诊断中的指导作用。结果显示血清中CYFRA21-1、CEA、CA125水平肺部良性病变组均在正常值范围内，肺癌组均较正常值为高，二者比较具有显著意义（P<0.05）。血清CYFRA21-1水平以小细胞癌表达量最多，肺鳞癌和肺腺癌较肺部良性病变组明显不同。研究结果表明：与健康对照组比较，肺癌组各项指标显著升高（P<0.05），且有统计学差异；不同性别间无明显差别；老年组与青年组无显著差异。说明癌症是可以预防和治疗的。关键词：血清肿瘤标志物；联合检测；肺癌诊断目录TOC\o"1-3"\h\u7190摘要 I20541第一章前言 131975第二章资料与方法 2109482.1一般资料 2154732.2方法 2280892.3统计学方法 718702第三章结果 8312203.1标本男女分布结果 8219563.2恶性疾病分类情况 844093.3肺癌组和良性病变组的检测结果 825308第四章讨论 920443参考文献 11第一章前言肺癌的发病率占当代世界恶性肿瘤的首位，东南亚乃至全世界的发病率与死亡率占恶性肿瘤的第一位。据WHO统计，世界各国癌症死亡率在过去10年内呈逐年上升趋势，其中以肺癌的死亡率最高。据统计，世界上每4个人中即有1人死于肺癌。目前已确认的肺癌病因多达200多种。其中以吸烟为主的环境因素为最常见因素之一。因此，预防和治疗肺癌是医学界面临的重要课题。在我国每年约有60万例左右的肺癌患者，而且每年新发肺癌的人数也在逐年增多，因此对肺癌尤其是晚期肺癌的治疗已成为提高病人5年生存率的关键。肺癌分为非小细胞肺癌与小细胞肺癌两大类，NSCLC分为肺腺癌，肺鳞癌，腺鳞癌，大细胞肺癌及肉瘤样癌等不同类型。肺腺癌是最常见的类型之一，也是最严重的类型（NSCLC除外），其发病率随年龄增长而增加。因发病年龄主要集中于45岁以上者，大约占常发病的比例，故又称“老年肿瘤”。因肺癌早期症状类似肺部良性疾病，故不易觉察，常易忽视，有典型症状者多已属晚期，已经错过了手术时机，虽可接受放，化疗，但是临床治疗效果不佳，预后不佳，对病人在经济上和心理上均造成了沉重负担。由于这类肿瘤具有高度异质性，临床表现多样化以及对化疗不敏感等特点，故其临床治疗十分棘手。目前仍无根治方法，只能采取以手术为主的综合疗法。随着分子生物学技术的发展。肺癌严重威胁着人类健康与生命，故早期发现、早期诊断、早期治疗对降低肺癌死亡率具有重要意义。第二章资料与方法第二章资料与方法2.1一般资料2.1.1样本来源选择郑州地区2019-03到2020-03期间入院诊断为原发性肺癌的患者65例为研究对象，男45名，女20名，年龄在37-81周岁之间，平均年龄为65.3周岁，所有患者均经过手术后病理，纤维支气管镜病理或者细胞学诊断为原发性肺癌。所有病例均接受过胸部X线片和CT检查；并对其行痰液涂片及培养分析。它的组织学分型有肺鳞癌32个、肺腺癌24个、小细胞肺癌9个。肺部良性疾病组30名，男20名，女10名，年龄27～88周岁，平均年龄53.7周岁，主要表现为肺炎，肺结核，结核性胸膜炎，炎性假瘤，支气管炎，肺脓肿，支气管扩张症，均为临床或病理证实。2.1.2仪器与试剂实验仪器：主要包括：上海55p-72型离心机、酶标仪RT-2100C(Rayto)、上海HH-W21-60型电热水浴恒温箱、低温冰箱采用北京DXZ25-37U、微量加液器和吸头以及EP离心管。药物和试剂：包括：CEA药物与试剂、CA125药物和试剂以及CYFRA21-1药物和试剂2.2方法2.2.1CEA标本测定方法实验前，必须完全混合试剂或稀释在室温下逐渐平衡的样品，并尽可能避免起泡现象。4.用紫外分光光度计测定了不同种类和用量的药物样品中盐酸林可霉素（PCBr），硫酸阿托品及安替比林3种成分的相对含量。试验前要先估算出样品中的量，若样品中的浓度过高，将样品稀释使得处于试剂盒检测的范围之内，最终计算出结果时乘上样品稀释倍数最终得到待测试样的真实浓度。样品采集。取健康无病家兔20只随机分为两组：试验组给予复方丹参注射液；对照组不做任何处理。观察结果与文献报道一致。结论该研究为临床提供了可靠的实验依据。晨起（空腹8h以上）取静脉血5ml，置干燥试管中置4°C3000rpm离心取上清，标本置超低温冰箱-80°C保存。操作步骤：1、将标准品稀释并加样：选取酶标包被板中的十个标准品通孔，将标准品稀释。将上述方法应用于6种不同浓度的样品（3组），并采用HPLC测定了其相对含量；之后再用同样的方法检测了4种同浓度的样品；结果相同；说明此方法准确可靠；重复性好；稳定性高；成本低；方便实用。然后将第三孔，第四孔的稀释液又各取50微米的药液分别入加至第五孔，第六孔，第五孔，第六孔中滴加至标准品稀释液50微米的稀释液，并轻轻搅拌;;然后将第五孔，第六孔内的稀释液分别入加至第七孔，第八孔中滴加于标准品稀释液50微米的稀释液，并将稀释液轻轻搅拌；最后将第五孔，第七孔和八孔内的稀释液依次滴加至第七孔和十孔，第五孔和十孔中的稀释液按稀释液的稀释量依次滴加至第五孔和十孔内;最后将第五孔和八孔中滴加有稀释液的稀释液按稀释液的稀释剂的稀释液轻搅拌;将第五孔中滴加完稀释液。稀释后各孔浓度分别是1800ng/L，1200ng/L，600ng/L，300ng/L，150ng/L。2、加样：设空白孔（空白孔是指对照孔中未添加样品及酶标试剂；其他操作等步骤都一样）及待测样品孔。在酶标包被板上待测样品孔内谨慎地添加稀释液40微米，之后添加待测样品10微米。反应结束后加样量一般为0.5～1.0mL,用蒸馏水或缓冲溶液洗涤干净并干燥。将待测物放入装有酶标板的载玻片上进行检测。如果是纯物质可以直接测定；若含有杂质则需处理后方可使用。方法简便。快速。重现性好。操作方便。加样后将试样仔细添加到酶标板孔底，再轻轻摇晃搅拌。3、温育，将酶标包被板封板膜封板，置于37摄氏度温育箱内温育30分钟。4、配液，将浓缩洗涤液与蒸馏水混合30倍，备用。5、清洗：将封板膜仔细取出温育30min，弃去孔内的液体，甩去水分，滴洗涤液并静置30秒再甩去水分，一共清洗5遍，再将酶标包被板轻轻拍打晾干。6、加酶：酶标包被板上各孔中除空白孔外各加酶标试剂50微米。7、温育，将酶标包被板再用封板膜封板，然后置于37℃的温育箱内温育，温育30min。8、清洗：将封板膜经温育30min仔细除去，弃去孔内的液体甩去，滴洗涤液静置30秒甩去，如此重复清洗5次，再将酶标包被板轻轻拍打晾干。9、显色：先将50μl显色剂A放入孔中，再将50μl显色剂B放入孔中，最后轻轻震动搅拌，于37摄氏度温度和避光环境中反应15min。10、终止反应：在每个标准孔中加入50微米的终止液终止反应的基准是：标准孔中的物质由蓝变成了黄。11、测量：将酶标仪中空白孔调零作为对照标准，于450nm波长处测各孔吸光度，称为OD值。将酶标抗体与被测血清反应并显色，用比色法测量吸光度，根据测得的结果计算出各样品中相应的浓度。该方法可以同时检测多个样品；灵敏度高、重现性好；操作简单；特异性强；快速准确；重复性好；方便实用；成本低廉；经济实惠。并于添加终止液15min内进行测定。12、计算：绘制坐标图（坐标表示参考物质的浓度，纵轴表示OD值），并在绘制过程中绘制标准曲线。根据每个OD值，可以从标准曲线中找到相应的浓度，乘以样品实际浓度的稀释倍数。2.2.2CA125标本测定方法实验前在室温下平衡的试剂或样品应在稀释过程中充分混合，搅拌过程中尽量不要起泡。采用紫外分光光度法测定了不同条件下制备得到的纳米TiO2薄膜样品在紫外光照射后的光催化性能。结果表明：随着TiO2颗粒粒径的减小和光催化活性的增加,TiO2膜的光降解效率也随之提高。结论：数据拟合效果较好。结果稳定。精确度高。误差小。精度高。在试验之前先对试样含量进行预测，若试样浓度过高，先将此试样按对应比例稀释，并在计算出结果后将其与对应稀释倍数相乘，最终得到待测试样的真实浓度。样品采集。取健康无病家兔20只随机分为两组：试验组给予复方丹参注射液；对照组不做任何处理。观察结果与文献报道一致。结论该研究为临床提供了可靠的实验依据。晨起（空腹8h以上）取静脉血5ml，放置在干燥的试管中，以4℃3000rpm速度离心并分离上半身。将样品储存在超低温冰箱-80℃中。操作步骤：1、对标准品进行稀释及加样处理：选取酶标包被板中的十个标准品通孔，将标准品100微米L,稀释液50微米L,将标准品滴加样处理。这样就可以得到每个反应体系所需要的标准品溶液了。实验结果表明该方法具有较好的重复性，而且灵敏度高，结果准确可靠，可用于实际样品检测工作中。建立了一种高效液相色谱-质谱联用分析方法。然后将第三孔，第四孔的稀释液又各取50微米的药液分别入加至第五孔，第六孔，第五孔，第六孔中滴加至标准品稀释液50微米的稀释液，并轻轻搅拌;然后将第五孔，第六孔内的稀释液分别入加至第七孔，第八孔中滴加于标准品稀释液50微米的稀释液，并将稀释液轻轻搅拌；最后将第五孔，第七孔和八孔内的稀释液依次滴加至第七孔和十孔，第五孔和十孔中的稀释液按稀释液的稀释量依次滴加至第五孔和十孔内;最后将第五孔和八孔中滴加有稀释液的稀释液按稀释液的稀释剂的稀释液轻搅拌;将第五孔中滴加完稀释液。稀释标准浓度为360pg/ml、240pg/ml和120pg/ml，60pg/ml或30pg/ml。2、加样：单独设置空白孔（空白孔为对照孔、操作时不加试样和酶标试剂、其他各项操作步骤等均相同）和待测试样孔。取40μm样品稀释液滴入酶标包被板的待测样品孔。随后加入10微米待测样品。在操作过程中向酶标板孔底添加液体。并轻轻摇晃搅拌均匀。将上述两种方法测得的结果进行比较。结果表明：用空白孔法所得测定值与标准曲线法测得的数值相近；用空白孔法所测出的数据相对于标准溶液更为准确。这时试样最后稀释倍数是五倍。3、温育，封板膜封板，放入37摄氏度的温育箱，温育30分钟。4、配液，浓缩洗涤液加蒸馏水30倍稀释备用。5、清洗：温育30min揭去封板膜丢液后每孔各加洗涤液一次以免起泡，30秒后轻甩酶标包被板上的药液，这样反洗五次后再轻拍晾干。6、加酶：在空白孔中不添加酶标试剂，在剩下的每一个孔中添加50微米的酶标试剂。7、温育，将酶标包被板封上封板膜，放入37℃的环境中温育30min。8、清洗：注意将封板膜除去，弃去孔口内的药液后甩去，每个孔口单独加入洗涤液，30秒后弃去，反复操作五次，再轻轻拍打。9.显色：A50μl,B50μl显色剂依次加入标准孔内，再轻轻震动搅拌均匀，避光，37℃的环境显色15min。10、结束：向每一个标准孔中加入50微米的结束液，使反应结束，标准孔中的物质从蓝色变为黄色时，说明已结束。11、确定：需加入终止液15分钟内进行。实验所用酶系由两种方法制备而成。一种是以碱性蛋白酶和中性蛋白酶分别消化组织样品，再加入缓冲液调pH值至7.0～7.5；另一种是利用组织培养技术得到细胞悬液。用分光光度计直接测其吸光值；计算出浓度。结果准确可靠。重复性好。数据稳定。以空白孔作标准调零，酶标仪450nm处依测各孔吸光度。12、计算：由坐标图（坐标为标准物浓度、纵坐标为吸光度）所绘标准曲线求得各吸光度所对应的浓度并乘稀释倍数得到待测样品。2.2.3CYFRA21-1标本测定方法样品采集。采自患急性胰腺炎的患者或疑似病人；采用常规方法进行实验室检测。结果：所有病例均符合《中华人民共和国卫生部药品标准》[1]对中药注射剂质量控制指标要求。结论：本实验为临床合理用药提供了科学依据。早上（空腹8小时以上）采集静脉血5ml，置于干燥试管中，在4℃、3000rpm下离心15分钟，并储存在超低温冷冻柜中，上体温度为80℃。操作步骤：实验前，应在稀释试剂或样品时将其混合，以将试剂平衡至室温，在搅拌过程中尽可能避免气泡出现。将样品溶解于一定量的稀释剂中，然后用比色法测定其溶液的吸光度值，从而得到待测样品的含量。在测量完成之后，需要计算出各组分的质量百分比和相对百分含量。在试验之前先预测试样含量，若试样浓度较大，将此试样稀释至试剂盒检测范围内，待结果时乘上对应稀释比例得到待检测试样真实浓度。1、加样，分别开设空白孔，标准孔，待测样品孔。2.配样：将酶标抗体与底物溶液充分混匀后加入酶标板中进行反应，然后取出并移入离心管内继续搅拌。在酶标板孔底加入待测样品，在空白孔中加入样品稀释液100微米，在标准孔及待测样品孔中分别加入标准品及待测样品各100微米，应尽量避免气泡出现，勿与酶标板孔壁接触，并轻轻摇晃搅拌。所述酶标板覆盖覆膜。2、温育，酶标板在封板膜上封板，然后置于37°C的温育条件下，120min即可。3、加入检测溶液答：弃去酶标板孔中的药液，轻轻甩去，注意不必清洗。用棉签将孔壁擦干净；然后把酶标板放在装有酒精或生理盐水的试管内（可直接用此试剂），并用胶布固定在载玻片上；再放入恒温水浴中培养24小时；每孔加检测溶液A工作液100μL,覆盖覆膜后再在37°C环境中温育60min。4、清洗：60min后弃去酶标板孔中的药液，轻甩干净，反复洗三次板，每次泡2min,最后将酶标板孔中药液轻拍晾干。5、添加检测溶液B：在每个孔中分别添加100微米的检测溶液工作液B,覆膜后再置于37摄氏度温育60min。6、清洗：60min后轻甩，弃去酶标板孔中的药液，清洗5遍，每遍浸没2min,最后轻甩酶标板孔。7、加底物，按顺序每孔仔细添加90μl底物溶液。8、显色，用酶标板覆盖覆膜，避光显色，显色温度37摄氏度。用紫外分光光度法测定显色剂和参比物的吸光度，根据两者比值计算出待测液中目标物质含量。10.定性：用气相色谱法检测结果与对照相比无显著性差异。显色标准肉眼可见标准品前面3～4孔呈明显梯度蓝色，后面3～4孔则梯度显示不是很明显，反应可终止。9、终止显色，按顺序在每个酶标板的孔中仔细地加入50微米的终止溶液，使反应结束。10.加入底物后，用紫外分光光度法测定其最大吸收波长为440nm,在该位置测得的吸光度与空白值间有良好线性关系（r=0.9999）。操作简单快速。适合推广使用。12.无明显干扰现象。这时可观察孔内容物从蓝变为黄。10、测OD：终止反应15min内，利用酶标仪分别于450nm波长处测量各孔道吸光度，称为OD。11、计算：画出坐标图（坐标为标准物浓度、纵坐标为OD值），同时画出标准曲线，依据试样测得的OD值可由标准曲线求出对应浓度；然后乘上稀释倍数，求出试样的真实浓度并记录下来。2.3统计学方法全部实验数据的计量资料以x±s的形式表达，计数资料使用SPSS21.0统计软件包做方差分析。结果：本研究提示在一定范围内,β-内酰胺类抗生素对肺炎链球菌的体外抗菌活性具有剂量依赖关系，并且与青霉素和链霉素相比，其疗效更佳。结论:β-内酰胺类是一种理想的抗菌药。第三章结果第三章结果3.1标本男女分布结果恶性组和良性组加在一起95例。其中男性65例，女性30例。图3-1标本男女分布饼状图3.2恶性疾病分类情况恶性疾病65例，鳞癌32例，腺癌24例，小细胞癌9例。图3-2恶性疾病分类饼状图3.3肺癌组和良性病变组的检测结果表3-1显示，良性肺病患者血清CYFRA21-1、CEA和CA125含量均在正常范围内，肺癌患者各项指标均高于正常值，两者存在统计学上的差异（p<0.05）。表3-1三项标志物在肺癌组和良性病变组中的检测结果（x±s）组别例数CYFRA21-1（ng/mL）CEA（ng/mL）CA125（U/mL）肺良性病变组302.26±0.584.24±1.0622.18±3.63肺癌组6510.01±2.1912.33±2.53131.48±28.33注：P<0.05第四章讨论第四章讨论肿瘤标记物通常具有以下特征。1.瘤是恶性肿瘤细胞。2.恶性肿瘤细胞的组织学分类具有特异性。3.从宿主的体液和分泌物中检测出恶性肿瘤组织，以确认肿瘤的存在。4.可以作为一种生物标记物，用于疾病早期诊断和预后判断等方面。5.与其它检查方法相结合使用时可获得更高的敏感性和特异度。目前，临床上尚未发现肺癌的肿瘤标志物。同时检测肿瘤标志物可以提高诊断和检测速度。CEA是一种由内胚层上皮细胞胞浆产生的复合酸性蛋白复合物（CEA），具有高多糖含量，具有免疫抑制和促进肿瘤转移的作用。CEA最早发现于结肠癌和胎儿组织，广泛分布于消化系统恶性肿瘤中。它最初用于检测消化器官的癌症，尤其是癌症和其他恶性疾病。CEA也存在于良性疾病患者的血清中，如胰腺炎和肺炎。有时和炎症程度呈正性关系，通常增高不大，甚至呈一过性增高，正常人血清可检出微量CEA。肺癌组织细胞中,CEA的检出率约为40%～80%，它已成为检测肺癌的重要肿瘤标志物。肺癌患者（如胸腔积液）的血清和体液CEA水平在肿瘤通过基底膜后显著升高，且与病变体积大小，播散程度及临床TNM分期等有密切关系，经手术清除病变后血清CEA水平显著降低。近年来,CEA作为一种新型生物标志物被广泛应用于多种癌症疾病诊断及疗效观察，包括原发性肝癌、胃癌、食管癌、胰腺癌、乳腺癌以及恶性淋巴瘤等疾病的临床研究。显示其良好的应用前景。目前已成为国际上热门课题之一。但CEA特异性差，敏感性低，因此对于单项检测在恶性肿瘤性疾病早期诊断中作用较小，通常多用于评估结肠癌及肺癌的疗效，病情变化进展及预后。本次研究表明：CEA含量在肺癌病人血清中比肺部良性疾病病人显著增高（P<0.05），且在肺腺癌病理学分型中表达量最多，提示CEA在诊断肺癌，区分肺癌和肺部良性疾病，判断肺