(高清版)GBT 40255-2021 对虾肝胰腺细小病毒病诊断规程 PCR检测法

ICS65.020.30GB/T40255—2021对虾肝胰腺细小病毒病诊断规程国家市场监督管理总局国家标准化管理委员会IGB/T40255—2021本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由中华人民共和国农业农村部提出。本文件由全国水产标准化技术委员会(SAC/TC156)归口。本文件起草单位：中国水产科学研究院黄海水产研究所、全国水产技术推广总站。1GB/T40255—2021本文件规定了对虾肝胰腺细小病毒病诊断规程中普遍适用的核酸检测技术的要求，针对肝胰腺细验步骤和结果判定。本文件适用于对虾各生活期样品中HPV带毒情况的定性检测，以进行对虾肝胰腺细小病毒病的2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文GB/T28630.4—2012白斑综合征(WSD)诊断规程第4部分：组织病理学诊断法本文件没有需要界定的术语和定义。bp:碱基对(basepair)DNA:脱氧核糖核酸(deoxyribonucleicacid)dNTPs:脱氧核糖核苷三磷酸(deoxy-ribonucleosidetriphosphate)EDTA:乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraaceticacid)HCl:盐酸(hydrogenchloride)HPV:肝胰腺细小病毒(hepatopancreaticparvovirus)NaOH:氢氧化钠(sodiumhydroxide)PCR:聚合酶链式反应(polymerasechainreaction)SDS:十二烷基硫酸(sodiumdodecylsulfate)TE:Tris盐酸和EDTA缓冲液(EDTATris·HCl)Tris:三羟甲基氨基甲烷(trishydroxymethylaminomethane)2GB/T40255—20215试剂或材料5.1除非另有说明，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂和蒸馏水或去离子水或相当纯度的水。5.5蛋白酶K:按A.7配制。5.7Tirs饱和酚(pH≥7.8):分析纯。5.8酚/氯仿/异戊醇(25:24:1):分析纯。5.9氯仿/异戊醇(24:1):分析纯。5.1170%乙醇：按A.11配制。5.12dNTPs(各2.5mmol/L):生化试剂，含dATP5.16引物HPV-F(10μmol/L):5'-GGT-GAT-GTG-GAG-GAG-AGA-3',-20℃保存。5.17引物HPV-R(10μmol/L):5'-GTA-ACT-ATC-GCC-GCC-AAC-3',-20℃保存。扩增HPV核酸中的628bp片段。5.18内参引物CF(10μmol/L):5'-TGC-CTT-ATC-AGC-TNT-CGA-TTG-TAG-3',-20℃保存。5.19内参引物CR(10μmol/L):5'-TTC-AGN-TTT-GCA-ACC-ATA-CTT-CCC-3',-20℃保存。扩增十足目生物DNA中的848bp片段。5.20PCR检测阳性对照为已知受HPV感染且PCR结果显示阳性的对虾组织，-70℃保存。5.21PCR检测阴性对照为已知未受HPV感染且PCR结果显示阴性的对虾组织，-70℃保存。5.22PCR检测空白对照以灭菌双蒸水作模板。6.3水平电泳槽。6.4紫外观察仪或凝胶成像仪。6.5高速离心机。6.6水浴锅或金属浴。6.7普通冰箱。3GB/T40255—2021采样数量、方法和保存运输应符合GB/T28630.4—2012附录B的要求。8试验步骤8.1DNA的提取设置阳性对照和阴性对照。8.1.2加入2.5μL20mg/mL蛋白酶K,至终浓度100μg/mL,混匀后置于50℃水浴3h,不时旋动。8.1.3将溶液冷却至室温，加入等体积平衡酚，颠倒混合10min,于10000r/min离心3min分离两相。8.1.4水相移至新1.5mL离心管中，加入等体积酚/氯仿/异戊醇(25:24:1),颠倒混合10min,于10000r/min离心1min分离两相。8.1.5水相移至一新1.5mL离心管中，加入等体积氯仿/异戊醇(24:1),颠倒混合10min,于8.1.7用70%乙醇洗涤沉淀2次，每次10000r/min离心5min,小心弃掉上清，将沉淀于室温晾干。8.1.8加入100μL灭菌双蒸水溶解DNA。8.1.9若DNA样品需要保存，可溶解于100μLTE缓冲液中并保存于—20℃。8.1.10可采用同等抽提效果的其他方法或使用商品化DNA提取试剂盒。8.2.1PCR反应体系：按照表1的要求，加入除TaqDNA聚合酶以外的各项试剂，配制成大体积的预混物，分装保存于-20℃。临用前，加入相应体积的TaqDNA聚合酶，混匀，按1个反应体系/支分装4GB/T40255—2021试剂试剂终浓度10×PCR缓冲液(无Mg²+)1×PCR缓冲液4mmol/LdNTPs(各2.5mmol/L)引物HPV-F(10μmol/L)引物HPV-R(10μmol/L)灭菌双蒸水TaqDNA聚合酶(5U/μL)0.02U/μL8.2.2将上述加有DNA模板的PCR管按以下程序进行扩增：94℃预变性5min;94℃变性1min、8.2.3每份样品均设立十足目生物内参对照，扩增十足目生物组织DNA的PCR反应体系按照表2的试剂25pL体系试剂终浓度10×PCR缓冲液(无Mg²+)1×PCR缓冲液dNTPs(各2.5mmol/L)内参引物CF(10μmol/L)内参引物CR(10μmol/L)灭菌双蒸水TaqDNA聚合酶(5U/μL)0.02U/μL8.2.4按以下程序进行扩增：94℃预变性3min;94℃变性1min、55℃退火1min、72℃延伸1min,8.3.1配制1.5%的琼脂糖凝胶，加入10mg/mLEB至终浓8.3.2将5pLPCR反应产物与1μL6×载样缓冲液混匀后加入加样孔中。同时设立DNA分子量标8.3.3在1V/cm～5V/cm的电压下电泳，使DNA由负极向正极移动。当载样缓冲液中溴酚蓝指示剂的色带迁移至琼脂糖凝胶的1/2～2/3处时停止电泳，将凝胶置于紫外观察仪或凝胶成像仪下观察或拍照。5GB/T40255—20219结果判定9.1检测结果成立条件十足目生物组织样品在848bp处有特定条带，阳性对照在628bp处有特定条带，阴性对照在628bp处无条带且空白对照不出现任何条带，实验有效。9.2检测结果判定检测样品在628bp处有条带，测序结果同参考序列(参见附录C)进行比对，结果符合的可判为PCR结果阳性；检测样品在628bp处无条带可判为PCR结果阴性。6A.11mol/LTris·HCl(pH8.0)Tris水(规范性)试剂配方gmL溶解后加入约42mL浓盐酸调pH接近8.0,冷却至室温，再用2.5mol/LHCl调整pH至8.0。加水定容至1000mL分装后，高压蒸气灭菌，室温贮存。A.20.5mol/LEDTA(pH8.0)乙二胺四乙酸二钠(EDTA-Na₂·2H₂O)18.6g磁力搅拌，用2.5mol/LNaOH调节溶液pH至8.0,完全溶解，定容至100mL。高压蒸气灭菌，室温贮存。A.3TE缓冲液(pH8.0)1mol/LTris·HCl(pH8.0)10mL0.5mol/LEDTA(pH8.0)2mL加水定容至1000mL高压蒸气灭菌，4℃贮存。A.41mg/mL胰RNA酶TE缓冲液(pH8.0)10mL溶解后，于100℃加热15min,缓慢冷却至室温，分装100μL/管，—20℃贮存。水gmL加热至68℃助溶，加入几滴浓盐酸调节溶液pH至7.2,加水定容至100mL。室温贮存。若溶液有结晶形成，用前加热融解即可。SDS微细晶粒易于扩散，称量时要戴面罩，称量完毕后要清除残留在称量工作台区和天平上7GB/T40255—2021A.6抽提缓冲液lmol/LTris·HCl(pH8.0)lmL0.5mol/LEDTA(pH8.0)20mL1mg/mL胰RNA酶2mL10%SDS加水定容至100mL混匀，室温贮存。A.720mg/mL蛋白酶K蛋白酶K20mg溶解后分装于1.5mL离心管中(0.25mL/管),—20℃下保存。A.810mol/L乙酸铵乙酸铵77g加水定容至100mL,经0.45μm滤膜过滤除菌。4℃贮存。A.950×电泳缓冲液Tris242g冰乙酸57.1mL0.5mol/LEDTA(pH8.0)100mL加水定容至1000mL室温贮存。A.101×电泳缓冲液50×电泳缓冲液20mL加水定容至1000mL室温贮存。无水乙醇70mL加水30mL,混匀，定容至100mL分装后，室温贮存。8GB/T40255—2021A.1210mg/mLEB贮存液磁力搅拌数小时以确保其完全溶解。室温保存于棕色瓶或用铝铂包裹的瓶中。9GB/T40255—2021(资料性)对虾肝胰腺细小病毒病简介对虾肝胰腺细小病毒病(Infectionwithhepatopancreaticparvovirusofpenaeidshrimp)是由肝胰腺细小病毒(HPV)感染引起的对虾疾病，在病毒分类中属于细小病毒科(Parvoviridae),浓核病毒亚科(Densovirinae)。HPV核酸为单链线性DNA,基因组大小约6kb,由单一核衣壳蛋白包裹。病毒粒子无囊膜，正二十面体形，直径22nm～23nm。基因组有3个开放阅读框(ORF),编码2个非结构蛋白和1个结构蛋白——核衣壳蛋白。目前，GenBank数据库中已提交的HPV全基因序列有5条，分别为泰国株(DQ002873)、澳大利亚株(DQ458781)、印度株(FJ410797)、中国株(GU371276)和韩国株(JN082231)。HPV不同地理株的基因序列分析数据表明HPV基因组存在较多的遗传变异情况。自1984年新加坡首次报道HPV感染野生墨吉对虾(Penaeusmerguiensis)以来，其他国家及地区HPV宿主范围广泛，主要的对虾养殖品种包括中国明对虾、印度明对虾(F.indicus)、凡纳滨对虾细角滨对虾(L.stylirostris)和罗氏沼虾(Macrobrachiumrosenbergii),在中国明对虾中尤为常见。病毒感染可导致幼虾死亡或引起矮小残缺综合征(RDS)。蟹类等其他甲壳类动物也可携带并传播该受感染宿主肝胰腺细胞内可观察到HPV病毒包涵体，宿主细胞细胞核形成“帽状结构”,伴随在HPV包涵体旁。GB/T40255—2021(资料性)肝胰腺细小病毒PCR产物序列1TCCGACTCGAGGGGGTGATGTGGAGGAGAGAATGTAACAATGCCTATGAAGTATAAAGAAHPV-F61CACAAGACTCATATGTTCAGGAAGCCTGTATTTTTGACTAATCAGCATCACCCATTGGTA121GACATATCACATTATGATGACAGAAGAGCTATAGAGAATAGAAGTTTCATGTATAAAGTA181GAGTTAGGAAAGGAACCAGTAAATGCACA