(高清版)GBT 40192-2021 刺盘孢属实时荧光PCR检疫鉴定方法

ICSCCS65.020.01GB/T40192—2021刺盘孢属实时荧光PCR检疫鉴定方法国家市场监督管理总局国家标准化管理委员会IGB/T40192—2021本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归口。本文件起草单位：中华人民共和国宁波海关、中国科学院微生物研究所、中华人民共和国乌鲁木齐1GB/T40192—2021刺盘孢属实时荧光PCR检疫鉴定方法1范围本文件描述了植物病原真菌刺盘孢属实时荧光PCR检疫鉴定方法。本文件适用于携带刺盘孢属病菌的植物及其产品中刺盘孢属病菌的检测筛查。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。SN/T2589植物病原真菌检测规范3术语和定义本文件没有需要界定的术语和定义。4刺盘孢属的分类信息根据《DictionaryoftheFungi》(第10版)(2008)分类系统，刺盘孢属隶属于真菌界(Fungi),子囊菌门(Ascomycota),粪壳菌纲(Sordariomycetes),小丛壳目(Glomerellales),小丛壳科(Glomerellaceae)。5鉴定原理根据刺盘孢属病菌的DNA序列特征，采用实时荧光PCR方法，应用所设计引物和探针对刺盘孢属病菌进行检测鉴定。6.1仪器设备和器具GB/T40192—20216.2试剂次氯酸钠、液氮、超纯水、十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)提取液(2%CTAB,1.4mol/LNaCl,醇、异丙醇、70%乙醇、核糖核酸(RNA)酶、实时荧光聚合酶链式反应(Real-timePCR)反应预混液：2×TaqManUniversalPCRMasterMix。除另有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂。6.3培养基马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA):将200g马铃薯去皮，切小块，沸水煮20min后过滤，弃去滤渣，在滤液中加入葡萄糖和琼脂粉各20g,加蒸馏水定容至1L。配成溶液后121℃下灭菌20min。7检疫鉴定7.1样品的采集与处理样品的采集、分离、纯化和培养按照SN/T2589植物病原真菌检疫鉴定方法进行。7.2核酸的制备采用基因组提取试剂盒制备DNA,或采用改良的十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)提取法，十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)提取法按照附录A的方法制备。7.3DNA纯度与浓度的测定用紫外分光光度计测定DNA的纯度与浓度，分别读取260nm和280nm处的吸收值，计为OD₂₆o、OD₂so。DNA的纯度OD₂₆o/OD₂so比值应为1.7～1.9,DNA的浓度为50倍的OD₂₆o(μg/mL)。DNA的浓度与纯度应符合实时荧光聚合酶链式反应(Real-timePCR)检测的要求。7.4实时荧光PCR检测实时荧光PCR按照附录B的方法检测。8结果判定以疑似分离物或样品的实时荧光PCR检测结果作为鉴定依据。疑似分离物：阳性对照和空白对照正常，出现典型扩增曲线判定为阳性；无典型扩增曲线判定为增加DNA用量2倍～10倍后再次测试，出现典型扩增曲线，且Ct值≤35,判定为阳性；其余情况判定为阴性。植物源样品应置于2℃~8℃冰箱妥善保存，对检出刺盘孢属病菌的样品应至少保存6个月，以备2GB/T40192—2021分离到的刺盘孢属病菌应接种于马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)中妥善保存。实时荧光PCR检测阳性结果的照片。由指定的单位或人员负责，主要考察试验原始数据记录及实时荧光PCR检测结果等资料的完整性3GB/T40192—2021(规范性)十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)提取DNA方法A.1收集培养分离得到的菌丝或植物样品，放入浸在液氮里的1.5mL离心管，用无菌塑料杵迅速碾碎。A.3冷却至室温后，12000r/min离心10min,取上清液至另一离心管中。A.4加入600μL三氯甲烷：异戊醇混合液(24:1),颠倒混匀后静置至其开始分层。A.512000r/min离心10min,取上清液至另一离心管中。A.6可重复A.4至A.5步骤1次～2次，视两相界面处杂质的多少而定。A.7上清液中加入等体积异丙醇，轻轻颠倒混合均匀后于4℃或-20℃冰箱中沉淀30min。注：DNA提取亦可采用商品化DNA提取试剂盒。4GB/T40192—2021(规范性)实时荧光PCR方法B.1引物及探针序列正向引物CLF:5'-AGAGGGTTAAACAGCACGTGAAA-3'。反向引物CLR:5'-GATTCACCGGACGCAAGTCT-3'。探针CLP:5'-FAM-TGTTAAAAGGGAAGCGCTT-MGB-3',3'端含有不发荧光的淬灭基团并具有MGB分子。探针5'端含有FAM报告荧光染料，PCR扩增反应体系为：2×TaqManUniversalPCRMasterMix12.5μL、引物CLF/CLR各后置于荧光PCR仪中进行反应。以刺盘孢属物种病菌的DNA作阳性对照、不含刺盘孢属病菌的DNA作阴性对照、以无菌蒸馏水作空白对照，每个样品设置3个重复。B.3扩增反应条件注：DNA模板的取量根据DNA的提取浓度纯度而调节。不同仪器可根据仪器要求将反应参数作适当调整。56[1]CaiL,HydeKD,TaylorPWJ,WeirBS,WallerJ,AbangMM,ZhangJZ,YangYL,PhoulivongS,LiuZY,PrihastutiH,ShivasapproachforstudyingColletotrichum.FungalDivers[2]CannonPF,DammU,JohnstonPR,WeirBS(2012).Colletotrichum-cufuturedirections.StudMycol73:181-213.[3]CrouchJA,BeirnLA(2009).Anthracnoseofcerealsandgrasses.FungalDivers39:19-44.[4]CrouchJA,ClarkeBB,HillmanthedivergentlineagesofColletotrichumcausinganthracnosediseaseinturfgrasthology96:46-60.[5]CrouchJA,ClarkeBB,WhiteJF,HillmanBI(2009a)sporedgraminicolousCol[6]CrouchJA,TredwayLP,ClarkeBB,HillmanBI(2009b).Phylogenetica[7]DammU,CannonPF,LiuF,BarretoRW,Guattotrichumorbicularespeciescomplex:importantpathogensoffieldandweeds.FungalDivers61:29-59.[8]DammU,CannonPF,WoudenbergJHC,CrousPW(2012a).Ttumspeciescomplex.StudMycol73:37-113.[9]DammU,CannonPF,WoudenbergJHC,JohnstonPR,WeirB,TanYP,ShivasRG,CrousPW(2012b).TheColletotrichumboninensespeciescomplex.StudMycol73:1-36.[10]DammU,O'ConnellRJ,GroenewaldJZ,CrousPW(2014).TheColletotrichumdestruc-tivumspeciescomplex-hemibiotrophicpathogensofforageandfieldcrops.StudMycol79:49-84.[11]DammU,SatoT,AlizadehA,etal.(2019).TheColletotrichumdracaemagnumandC.orchidearumspeciescomplexes.StudMycol92:1-46.[12]DammU,WoudenbergJHC,CannonPF,CrousPW(2009).Colletotrichumspecieswithcurvedconidiafromherbaceoushosts.FungalDivers39:45-87.[13]FarrDF,AimeMC,RossmanAY,PalmME(2006).Speciesvaceae.MycolResl10:1395-1408.[14]FreemanS,HorowitzS,SharonA(2001).PathogenicandnonpathogeniColletotrichumacutatumfromstrawberryandotherplants.Phytopathology91:986-992.[15]HydeKD,CaiL,CannonPF,CrouchJohnstonPR,JonesEBG,LiuZY,McKenzieEHC,MoriwakiJ,NoireungPningLH,PrihastutiH,SatoT,ShivasRG,TanYP,TaylorPWJ,WeirBS,YangYL,ZhangJZ(2009).Colletotrichu[16]LiuF,HydeKD,CaiL(2011).Neotgentofpotatoblackdotdiseaseandtomatoanthracnose.Mycology2:248-254.[17]LiuF,CaiL,CrousPW,DammU(2013a).CircumscriptionofpathogensColletotrichumlindemuthianumandC.nigrum.Mycologi[18]LiuF,DammU,CaiL,CrousPW(2013b).SpeciesoftheColletotrichumgloeosporioidescomplexassociatedwithanthracnosediseasesofProteaceae.FungalDivers61:89-105.[19]LiuF,CaiL,CrousPW,DammU(2014).TheColletotrichumgigasporumspeciescom-plex.Persoonia33:83-97.[20]LiuXY,XieXM,DuanJX(2007).Colletotrichumyunnanensesp.nov.,anewendophyticspeciesfromBuxussp.Mycotaxon100:137-144.[21]Marin-FelixY,GroenewaldJZ,CaiL,etal.(2017).Generaofphytopathogenicfungi:GOPHY1.StudMycol86:99-216.[22]PrihastutiH,CaiL,ChenH,HydeKD(2009).CharacterizationofColletotrichumspeciesassociatedwithcoffeeberriesinChiangMai,Thailand.FungalDivers39:89-109.[23]PrihastutiH,CaiL,CrouchJA,PhoulivongS,MoslemMA,McKenzieEHC,HydeKD