GB/T 42475-2023 化学品 中华蜜蜂急性经口毒性试验（正式版）

ICS13.300;13.020CCSA80化学品中华蜜蜂急性经口毒性试验Chemicals—ApisceranaceranaFabricius国家市场监督管理总局国家标准化管理委员会IGB/T42475—2023本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由全国危险化学品管理标准化技术委员会(SAC/TC251)提出并归口。本文件起草单位：中国科学院生态环境研究中心、北京科润天朗环境技术有限公司、中检科健(天津)检验检测有限责任公司、中国检验检疫科学研究院、厦门尹巢科技有限公司、广东铭凯科技有限公1GB/T42475—2023化学品中华蜜蜂急性经口毒性试验1范围本文件规定了使用小烧杯法和饲喂管法测定化学品对中华蜜蜂急性经口毒性的试验原理、试验方本文件适用于使用小烧杯法和饲喂管法测定化学品对中华蜜蜂的急性经口毒性。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文本文件。GB5749生活饮用水卫生标准3.1急性毒性acutetoxicity生物体短时间(1d～4d)内一次或多次暴露于某种化学物质而产生的明显不良反应。4试验原理用受试物与蜂蜜水混合成不同浓度的溶液饲喂中华蜜蜂，生物学背景见附录A。以48h为一个试验周期，在24h、48h时记录蜜蜂的死亡数，并计算各组死亡率，分别确定50%试验蜜蜂死亡时的受试5试验方法5mL小烧杯、温度控制及连续测温设备、加湿器及温湿度仪、饲喂管、精密天平(至少精确到5.2试验容器保证试验温度和湿度稳定。当受试物具有挥发性时，实验室应装有通风装置；当受试物不具有挥发性2GB/T42475—2023中华蜜蜂(ApisceranaceranaFabricius)成年工蜂，试验应选择同一批体长和年龄相似的成年工蜂。人工饲养的成年工蜂在试验前需要转入到试验用蜂笼进行为期一周的驯化，在驯化期间饲喂试验蜜蜂的驯养方法按照附录B进行。5.4试验用水试验用水使用饮用水(需除氯)或纯净水应符合GB5749的要求。除氯后的试验用水中氯化物含量应小于或等于250mg/L。试验用水的pH应为6.5～8.5。5.5试验条件试验在23℃~27℃、相对湿度为50%～70%的黑暗环境中进行；试验开始2h前停止喂食，试验过程中用小烧杯法或饲喂管法进行喂食；对照组中试验蜜蜂的存活率应大于90%。5.6受试样品制备将已知量的受试物溶于一定体积去离子水或蒸馏水中。如果受试物为水溶性，则可直接溶于喂饲剂或分散剂助溶(如二甲基亚砜、二甲基甲酰胺、丙酮等),配制试验物质储备液应使用分析纯试剂。所有受试物测试浓度组中助溶剂的用量应该相同，且其浓度一般不超过1%。贮备液的配制推荐使用机械方式(例如搅拌或超声),使受试物在稀释水中进行简单的混合或搅动。通过稀释储备液来配制所选定浓度的试验溶液。5.7试验步骤正式试验前先进行预试验，以确定试验中的浓度范围。配制一系列浓度，该系列浓度一般以10为5.7.2预试验方法与药剂母液混合，按等比序列配制成不同浓度的药液。取10mL配制好的药液移至放有脱脂棉的5mL小烧杯内，再将小烧杯倒扣于蜂笼顶部供蜜蜂取食。每个蜂笼放20只成年工蜂。每个处理组(包括空白对照组)设置3个重复。试验开始后每隔24h检查、记录各组蜜蜂中毒和死亡情况。3GB/T42475—2023药液配制同小烧杯法，将10mL配好的药液放入饲喂管中供蜜蜂取食。每4h记录一次药液消耗量。每只笼中一次性移入20只成年工蜂。每处理(包括空白对照)设置3个重复。在小烧杯法与饲喂管法在预试验中，根据蜜蜂最低全致死浓度与最高全存活浓度之间，以几何级数做间距，公比不超过2.2,至少选择5个浓度为正式试验的浓度，使死亡率分布在0%～100%。其浓度范围在3个依次的几何系列浓度中最好能够测得20%～80%的死亡率以估算LC₅。值。每个浓度组至少设置3个重复，供试蜂数量至少为20只，测试持续时间为48h。试验初始的4h,观察蜜蜂死亡数，从结果中减去。每隔24h对蜜蜂进行观察。如果试验蜂蜷缩于蜂笼底部不动，可视为已死亡。同时，记录内容还应包括各种观察到的异常行为(如蜜蜂在笼底部乱转，挤成一堆值及95%置信限。如研究时在预计一种受试物为低毒等情况下，应进行限度试验，以确定LC₅₀是否大于限度值。在本文件规定的试验条件下，若受试物的最大水溶解度大于2000mg/L时，则以2000mg/L为限度试验浓度进行试验。若受试物的最大水溶解度无法达到2000mg/L,则以受试物在介质中的最大水溶解度(或者是形成稳定分散溶液的最大浓度)为限度试验浓度进行测定。取20只中华蜜蜂成年工蜂进行试验，试验大于2000mg/L表示。6结果计算与表示中华蜜蜂急性经口毒性半数致死剂量LCso值的计算可采用寇氏法、直线内插法或概率单位图解法7质量保证与质量控制7.1正式试验至少设3组重复试验。试验结束时，对照组死亡率不应超过10%。如果在第一个24h之后死亡率持续增加了10%以上，则需要延长实验，最长至96h。7.2试验期间，试验环境温度恒定控制在23℃~27℃,相对湿度控制在50%～70%,且在黑暗环境下。7.3试验开始前，检测配制的受试物实际浓度，应不低于理论浓度的80%。8试验报告4GB/T42475—2023——受试物物理性质和相关物理化学性质；——蜂蜜水来源及配置方法； ——选择试验方法的原因和详细过程；——所用化学分析法的方法步骤以及试验结果；——试液浓度及每一推荐观察时间的LC₅值(置信度95%);——试验过程中死亡率为0的最大试验浓度(LC₀),试验过程中死亡率为100%的最小试验浓度(LC100);5GB/T42475—2023(资料性)蜂体长约11mm～13.5mm,蜂王体长约13mm～16mm6GB/T42475—2023(资料性)受试中华蜜蜂的驯养方法春夏季节将中华蜜蜂蜂箱置于实验室外搭建的遮雨棚内，定期查看蜜蜂酿蜜情况，酌情给予一定的意大利蜂多2h～3h,善于利用零星蜜源。造脾能力强，喜欢新脾，爱啃旧脾；抗蜂螨和美洲幼虫腐臭病冬季天冷后，于蜂箱内添加隔温板，往蜂排上添加一定量蜂蜜水以备蜂群过冬，并于蜂箱上添加稻草。如果温度仍然较低，可以将蜂箱转移到温室内。温室内种植草莓等蜜源植物，蜜蜂可以为其授粉，提高产量，丰富的蜜源也有利于蜜蜂生存，为毒理试验提供活力强的中华蜜蜂。注意定期检查蜂箱，及时清除闯入蜂箱的外族蜂，以防中华蜜蜂受攻击。保持蜂箱周围整洁干燥，防止传染病发生。受试蜜蜂的选择：应在试验温度的饲养室饲养一周以上，饲喂与试验中种类相同的足量蜂蜜水。训化期间，记录死亡率并按照以下的标准评判。1)7d内试验蜂死亡率大于10%:舍弃整批蜂。2)7d内试验蜂死亡率在5%～10%:再饲养7d;如果接下来的7d内试验蜂死亡率小于5%:接收本批蜂；如果接下来的7d内，试验蜂死亡率超过5%,舍弃整批蜂。3)7d内试验蜂死亡率小于5%:接收本批蜂。保证试验中使用的蜂没有明显疾病，舍弃所有病蜂。试验期间及试验前两周不应对蜂做任何疾病处理。经抗生素等化学物质处理的蜜蜂，在最后一次处理结束后的4周内不应用本试验。驯养期间环境记录见表B.1,饲养记录见表B.2。温度：T=℃相对湿度：%(相对湿度)时间示值异常情况及处理记录记录人日期h:min温度/℃温度/%1234567GB/T42475—2023批号喂食活动状况有无蜂王病虫害地方备注记录人蜜水清水正常异常有无有无室外室内8GB/T42475—2023(资料