(高清版)GBT 41309-2022 纳米技术 纳米材料的内毒素体外测试 鲎试剂法

Nanotechnologies—En国家标准化管理委员会国家市场监督管理总局发布国家标准化管理委员会纳米技术纳米材料的内毒素中国标准出版社出版发行开本880×12301/16印张1.25字数39千字2022年3月第一版2022年3月第一次印刷如有印装差错由本社发行中心调换版权专有侵权必究举报电话：(010)68510107IⅡGB/T41309—2022/ISO1GB/T41309—2022/ISO29701:2010本文件描述了应用鲨试剂法(LAL)评价体外生物系统应用的纳米材料的内毒素水平。该测试方本文件适用于体外样品的检测，同时这些方法也适用于通过非胃肠道途凝固蛋白原被LAL试剂中的凝固蛋白酶酶解后的产物。λ2标识凝胶LAL法鲎试剂的灵敏度或者显色鲨试剂法、浊度鲨试剂法标准曲线以EU/mL为单位的鲎试剂Limulusamebocyt鲨试剂测试Limulusamebocytelysatetest;利用LAL检测细菌内毒素的测试。4缩略语BET:细菌内毒素检测(bacterialendotoxintest)CSE:对照标准内毒素(controlstandardendotoxin)ECBS:生物标准化专家委员会(expertcommitteeonbiologicalstandardizatiEF:无内毒素(endotoxin-free)EU:内毒素单位(endotoxinunit)I/EC:抑制/增强对照(inhibition/eLAL:鲎试剂(Limulusamebocytelysate)LPS:脂多糖(Lipopolysaccharide)OD:光密度(opticaldensity)RSE:内毒素参考标准品(referencestandardendotoxin)WHO:世界卫生组织(WorldHealthOrganization)5测试前考虑因素5.1纳米材料的储存5.2储存容器3GB/T41309—2022/ISO室内环境中的灰尘通常含有大量的内毒素。在纳米材料制备和处理过程中应特别注意避免接触灰尘。需要具备洁净空气的实验条件(见7.5)。——手动研磨；——机械研磨；——超声分散。为避免颜色的干扰，优选没有pH指示剂(酚红)的反应介质或缓冲盐水作为浸提介质。浸提介质宜确认无内毒素或由无内毒素试剂配制。在浸提介质中添加抗生素和抗真菌药物可以有效防止细菌和真菌的生长。宜验证所添加的抗菌物质对LAL试剂的干扰(见8.3.3)。浸提后，浸提复合物需要离心去除颗粒物；作为LAL测试的测试样品的上清液需要利用无内毒素枪头收集到无内毒素的管或容器中。由于测试样品在储存过程中会发生内毒素降解或细菌生长，样品制备后应尽快进行检测。测试样品应在2℃~8℃条件下储存在无内毒素、可封口的容器中(见5.2)。如果测试样品存储时间超过424h,应验证测试样品在储存过程中的稳定性和均一性。室内环境中自来水和灰尘通常含有大量的内毒素。纳米材料应利用无内毒素介质和无内毒素设制备测试样品使用的器材和实验室玻璃器需要经过不低于250℃持续至少30min,或其他证实有效的温度和时间组合(例如180℃至少处理3h或650℃处理1min)的处理，以去除内毒素。热不稳定或不适合用热处理的材料应用其他方法减少内毒素。碱或氧化剂浸泡后再用无内毒素水冲洗是一种有来冲洗这些设备和实验室器皿。尽管蒸馏能够有效地去除污染水中的内毒素可能由于设备使用不当或者处理不当，导致内毒素污染(见参考文献[11])。应定期检测室内制备的蒸8测试方法8.1原理内毒素活化LAL试剂中的一个因子，引起蛋白级联酶解反应(见参考文献[12])。凝固酶原被活LAL浑浊，最终形成凝胶。凝胶的形成原则上通过倒置试管后肉苏氨酸-甘氨酸-精氨酸-对硝基苯胺(Boc-Thr-Gly-Arg-p-NA)。由于灵敏度低和在指定的时间点无法——一种是直接测量p-NA在405nm波长处的OD值；5——另一种是测量p-NA的叠氮化品红衍生物在540nm~550nm波长之间的OD值。测量405nm波长处的OD值的商品化终点显色法的灵敏度为0.01EU/mL,而叠氮利用光学测定仪可以测定反应混合物达到预定的OD值所需时间、颜色和浊度变化的速率。考虑体外测试系统中产生生物反应的内毒素的临界浓度根据所采用的体外测试系统而变化。浓度为突状细胞和外周血单个核细胞中不能诱导明显的生物学反应(见参考文献[13])。需要根据体外测试系统所允许的内毒素的污染水平来选择适当的LAL测试。LAL试剂检测内毒素的灵敏度宜优于或至少8.3.2.1有些材料可干扰LAL测试。一些新合成的纳米材料可对LAL测试具有抑制/增强作用。8.3.3.2LAL反应的最适pH值在6～8之间。当测试受到抑制时，应使用适当的pH测试系统对实验样品和裂解物组成的反应混合物的pH值进行测量。应调整测试样品的pH值，以使反应混合物的6GB/T41309—2022/ISO7GB/T41309—2022/ISO29701:2010LAL测试潜在干扰示例A.1抑制剂A.1.2肝素(见参考文献[18])。A.1.4塑料(聚丙烯)(见参考文献[21A.1.5季铵功能化颗粒(见参考文献[22])。A.1.7蛋白酶抑制剂(见参考文献[24]A.1.8聚山梨酯20(见参考文献[25])。A.2增强剂EDTA-4Na(见参考文献[19])。8GB/T41309—2022/ISO29701:2010(资料性)B.1总则本附录描述了使用凝胶法LAL试剂预制管进行测试的过程示例。B.2试剂B.2.3对照标准内毒素冻干粉(CSE))。B.3设备B.3.6计时器。将装有对照标准内毒素(CSE)冻干粉的小瓶中，加入用EF-水，配制成CSE2λ四个浓度。制备校准CSE稀释样品是，对CSE储备溶液的稀释倍数不宜超过10,以尽量减少移液为了避免对测试样品的大量稀释，CSE溶液的最大加入的量不宜超过5%(例如，总I/EC体积为1mL 在测试样中加入EF-水，进行倍比稀释(如×2,×4,×8或更多),得到一系列测试样品稀释液。9GB/T41309—2022/ISOB.7实验过程B.7.1.1将制造商规定体积的EF-水(阴性对照)和校准标准CSE(0.25λ、0.5λ,λ和2λ,在EF-水中)加B.7.1.3为测试凝胶的完整性，将每个试管应以平滑运动翻转180°。如果在倒置时形成牢固的凝胶，则结果记录为阳性。如果没有形成牢固的凝胶或者形成了脆弱的凝胶，在倒置时流出，则结果记为B.7.1.5将产生阳性结果的最低CSE浓度定义为终点浓度。计算多次重复测试的终点浓度c的几何f——测量的次数。B.7.1.6LAL试剂在EF-水中的灵敏度宜在标定0.5λ~2λ范围内。B.7.2验证测试方法中混合。CSE标准和阴性对照设2个重复测试样，I/EC和测试样品设4个重复测试样。B.7.2.2测试应按照B.7.1.2和B.7.1.3的规定B.7.2.4I/EC样品终点浓度的几何平均值应按照B.7.1.5的规定计算，其值宜确定在0.5λ和2λ的范B.7.2.5如果I/EC中终点浓度的几何平均值超出上述范围，则应使用更大稀释倍数来稀释样品。LAL试剂标记的灵敏度宜乘以稀释度来进行校正。B.7.2.7当通过稀释测试样品或上述其他合理措施都未能克服干扰时，不宜将凝胶法LAL试剂应用B.7.3测试样品检测B.7.3.1(根据制造商的说明)将一定量的EF-水(阴性对照)、I/EC(如测试样品中的2A)、校准标准B.7.3.2测试应按照B.7.1.2和B.7.1.3的规定进行。GB/T41309—2022/ISO29701:2010(资料性)终点光度法C.1总则LAL试剂检测的实例。通过在405nm波长下的测量反应混合物光密度(OD)来测量p-NA的量。C.2试剂C.2.5终止溶液(见LAL试剂制造商的指导)。C.3设备C.3.1无内毒素玻璃管或聚苯乙烯微量滴定板(微孔板)。C.3.2无内毒素的玻璃器皿或聚苯乙烯管或容器，保证具有足够的容量来稀释内毒素标准品或测试C.3.8定时器。将装有对照标准内毒素(CSE)冻干粉的小瓶中，加入用EF-水，配制成CSE储备液。小瓶中CSEC.4.2校准CSE稀释样品的制备校准CSE稀释样品通过用EF-水稀释CSE储备溶液来制备。校准CSE稀释液应至少包括LAL试剂的标记灵敏度(λ)在内的3个浓度。CSE溶液应根据制造商的要求进行连续稀释，且稀释倍数不宜超过10,以尽量减少移液误差。GB/T41309—2022/ISO制备I/EC。(资料性)D.1总则D.2试剂D.2.4冻干对照标准内毒素(CSE)。D.3设备D.3.1无内毒素玻璃管或聚苯乙烯微量滴定板(微孔板)。D.3.2无内毒素的玻璃器皿或聚苯乙烯管或容器，确保具有足够的容量来稀释内毒素标准品或测试将装有对照标准内毒素(CSE)冻干粉的小瓶中，加入用EF-水，配制成CS校准CSE稀释样品应通过用EF-水稀释CSE原液来制备。校准CSE稀释液应至少包括LAL试超过10,以尽量减少移液误差。在未稀释的测试样品加入CSE溶液制备I/EC。I/EC中的内毒素浓度可以有多种选择(例如2λ、GB/T41309—2022/ISO29701:2010液的最大加入的量不宜超过5%(例如，总I/ECD.6测试过程D.6.1按照制造商的说明，用EF-水或合适D.6.3将试管或微量滴定板置于温度保持在(37±1)D.6.5确定反应混合物达到预定OD值(0、2OD单位或制造商规定的OD单位)所需的时间。达到预D.7.2阴性对照无反应(即阴性对照计算的内毒素值不宜D.7.4测试的准确度(变异系数，CV,%)宜在25%以内。D.9.1通过计算测试得到的内毒素浓度除以添加的标准内毒素浓度，计算I/EC中内毒素的回收率。D.9.2I/EC中内毒素的回收率宜在50%～200%之间。如果测试得到内毒素的回收超出上述范围，则测试样品有干扰。如果检测到干扰，宜使用无明显干扰的测试样本重复进行制备I/EC。GB/T41309—2022/ISO[1]ISO10993-12:2007Biologicalevalu[2]ISO14644-1Cleanr[3]ISO14644-2Cleanroomsandassovices(cleanairhoods,gloveboxes,isolatorsandmini-e[5]ISO/TS80004-1Nanotechnologies—Vocabulary—Pa[6]Nanotechnology[7]TAKAGI,T.etal.AminoacidsequenceofJapanesehorseshoetus)coagulogenBChain:Completionofthecoagulogensequence12.TheJournalofBi[8]POOLE,S.etal.Secondinternatiointernationalcollaborativestudy.JournalofEndotoxinResearch,4,1997,pp.221-231[9]SPAAN,S.etal.EffectofextractiAppliedandEnvironmentalMicrobiology,74,2008,pp.3804-3811[10]ESCH,R.K.etal.Endotoxincontaminationofengineere[11]USFDA,InspectionTechnpp.74-82[13]ZHONG,W.W.etal.RegulationofcytokinemRNAexpressioninstimulatedhumanmacrophages.ArchivesofSurgery,28,1993,pp.158-63;discussion,pp.163-164[14]VALLHOV,H.etal.Theimportanceofanenductionofnanoparticlesusedinmedicalapplications.NanoLetters,6,2006,p[15]cOOPERSTOCK,M.S.InactivationofendotoxinbypolymyxinB.AntimicrobialAgents[16]CARDOSO,L.S.etal.PolymyxinBasinhibitorofLPScontmansonirecombinantproteinsinhumancytokineterminationinperitonealdialysisfluidsandconcandBiomedicalAnalysis,26,2001,pp.811-818[18]SULLIVAN,J.D.andWATSON,S.W.Inhibitoryeffectofheparinforendotoxin.JournalofClinicalMicrobiology,2,1975,p.151[19]HOSOBUCHI,K.etal.RecoveryofBacterialEndotoxinfromMedicaofTokyoMetropolitanIndustrialTechnologyResearchInstitute.2007.NGB/T41309—2022/ISO29701:2[20]TSUCHIYA,M.CurrentstatusoftheapplicationofLimulustest.JournalofAntibacterial