GB/T 41522-2022 三种犬病病毒基因芯片检测方法（正式版）

ICSCCSGB/T41522—2022三种犬病病毒基因芯片检测方法2022-07-11发布国家市场监督管理总局国家标准化管理委员会IGB/T41522—2022本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由全国生物芯片标准化技术委员会(SAC/TC421)归口。物与食品检验检疫技术中心。1GB/T41522—2022三种犬病病毒基因芯片检测方法本文件描述了同时检测三种犬病病毒(CDV、CPV和CAV-1)的微阵列基因芯片检测方法和微流控芯片检测方法。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB19489实验室生物安全通用要求GB/T27401实验室质量控制规范动物检疫GB/T40458—2021用于病原微生物高通量检测的核酸提取技术规范本文件没有需要界定的术语和定义。4缩略语下列缩略语适用于本文件。BSA:牛血清白蛋白(BovineSerumAlbumin)CAV-1:犬1型腺病毒(Canineadenovirus-1)cDNA:互补DNA(ComplementaryDeoxyribonucleicAcid)CDV:犬瘟热病毒(CanineDistempervirus)CPV:犬细小病毒(CanineParvovirus)DEPC:焦碳酸二乙酯(DiethylPyrocarbonate)DNA:脱氧核糖核酸(DeoxyribonucleicAcid)dNTPs:核苷三磷酸(NucleosideTriphosphate)DMSO:二甲基亚砜(DimethylSulfoxide)DTT:二硫苏糖醇(Dithiothreitol)EDTA:乙二胺四乙酸(EthyleneDiamineTetraaceticAcid)PBS:磷酸缓冲盐溶液(PhosphateBufferedSaline)PCR:聚合酶链式反应(PolymeraseChainReaction)RNA:核糖核酸(RibonucleicAcid)2GB/T41522—2022Rnasin:核糖核酸酶抑制剂(RibonucleaseInhibitor)RT-PCR:反转录-聚合酶链反应(ReverseTranscriptionPolymeraseChainReaction)Tris-HCL:三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲液(TRISHydrochloride)在序列比对基础上，分别针对CDV、CPV和CAV-1保守区设计合成引物和探针。对于三种犬病病毒的微流控芯片检测方法，将引物分别固定在微流控芯片相应位置后，对微流控芯片进行封装，将提取的核酸模板与反应液(包含荧光物质)混合反应后，加入封装好的微流控芯片中，之后放入带有离心功能、恒温功能及实时荧光检测一体化的微流控芯片检测仪中，利用离心力驱动样品进入微流控芯片反应孔，进行恒温扩增。若样本中含有目的片段，则能够得到恒温扩增，扩增产物与荧光物质进行有效的结合，通过荧光检测仪实时捕获荧光信号，直观反应扩增产物的产生，根据实时荧光信6.1.4PCR仪。6.1.7高速微型离心机(离心速度12000r/min以上)。6.1.8台式高速离心机(离心速度3000r/min以上)。试剂均用无RNase污染的容器分装。3尿素，1%吐温-20。意事项应符合附录A和附录B中表B.1～表B.3的规定。中表C.2～表C.4的规定。微流控芯片试剂组分和存放条件应符合表C.1的规定。微流控芯片制作与4GB/T41522—2022样品采集后，放入密闭的塑料袋内(一个采样点的样品放一个塑料袋),采集的样品置保温箱中，加采集或处理好的样品在2℃~8℃条件下保存应不超过24h;若需长期保存，应放置于-70℃冰箱，避免反复冻融(冻融不超过3次)。液1mL转入无菌的1.5mL离心管中备用。制备的样品在2℃~8℃条件下保存应不超过24h,若需长期保存应置-70℃以下，避免反复冻融(冻融不超过3次)。7.2核酸提取CDV属于RNA病毒，CPV和CAV-1属于DNA病毒，本文件以常规核酸提取试剂(可同时提取DNA和RNA)为例说明核酸提取步骤，也可按照GB/T40458—2021的方法提取，还可采用其他等效7.2.2.3将蛋白酶混合物充分混匀后，按照每管20μL分装至各离心管中。振荡10s,56℃孵育10min;2℃~8℃8000r/min离心1min,取上清待用。7.2.3.3静置离心管10min,期间每隔2min上下颠倒离心管5次，使管内磁珠分布均匀。5GB/T41522—20227.2.3.4将离心管置于离心机上，2℃~8℃8000r/min离心1min,用移液器吸去管内液体。7.2.3.6将离心管置于离心机上，2℃~8℃8000r/min离心1min,用移液器吸去管内液体。7.2.3.8将离心管置于离心机上，2℃~8℃8000r/min离心1min,用移液器吸去管内液体。PCR仪反应。7.2.3.10以得到的PCR产物与基因芯片进行杂交，杂交反应体系组成应符合B.3的规定。芯片杂交杂交完毕后，弃去盖片，芯片探针面向下在少量预热的2×SSC(含0.2%SDS)中漂去残余杂交液(注意避免四个矩阵的杂交液交叉污染),撕去芯片上的橡胶围栏，在预热至42℃的杂交洗液I搅拌清洗4min,继续在预热至42℃的0.2×SSC中搅拌清洗4min,2000r/min离心1min,置于暗盒室温——阴性对照平均信号值=3个阴性对照点信号值的平均值一该点背景强度值；——检测点阳性判读标准：检测点信号值一该点背景强度值>2倍阴性对照平均信号值。7.2.6.2.1阴性对照信号值接近背景强度值。7.2.6.2.3若探针结合对照点中任何一个为阴性，则表明探针与片基结合存在问题；若杂交对照为阴则表明总RNA提取环节存在问题。出现上述情况任何一种，此次实验视为无效。6GB/T41522—2022微流控芯片的制作方法见附录D。样本芯片加样试剂准备：从-20℃取出试剂盒，将各试剂于室温下解冻，充分混匀并短暂离心后程序设置：1600r/min低速离心10s,4600r/min高速离心30s。温度为63.5℃,反应时间为采集荧光信号。的含有目标核酸序列的DNA片段。物),用来质控是否可以正常进行恒温扩增反应。阈值线一般情况设置为800(可根据实际情况进行调整，设定原则以阈值线刚好超过非典型S型扩增曲线的最高点，且Ct值显示为0),判定为阳性的Ct值设置为30,仪器配套软件自动分析结果。阳性对照出现明显的S型扩增曲线，阴性对照无明显的S型扩增曲线，内参引物检测孔在Ct值≤7GB/T41522—20228生物安全措施8.1实验室设备、设施要求及废弃物处理应符合GB19489的规定。8.2微流控芯片的检测工作应由具备生物实验操作经验人员承担。8.3检验过程中防止交叉污染的措施应按照GB/T27401的规定执行。8GB/T41522—2022(规范性)缓冲液配方以下所用试剂均为分析纯。A.1磷酸盐缓冲液A.1.1A液A.1.2B液0.2mol/LNa₂HPO₄水溶液：Na₂HPO₄·7H₂O53.6g,(或Na₂HPO₄·12H₂O71.6g或Na₂HPO₄·2H₂O35.6g)加蒸馏水溶解，最后稀释至1000mL。A.220×SCCNaCl175.3g、Na₃C₆H₅O₇·2H₂O88.2g,加超纯水至1000mL。充分溶解，室温保存。A.32×SCC20×SCC50mL,加超纯水至1000mL。充分溶解，室温保存。A.5DTTMgCl₂(0.1mol/L)SDS100g、超纯水900mL,加热至68℃以溶解SDS结晶，再加超纯水定容至1000mL,室温保存。A.750×Denhardt'sA.9洗液一9A.11洗液三A.12洗脱液A.13DEPC水微阵列芯片检测引物序列见表B.1所示，每对引物的上游引物的5′端标记荧光，用于杂交检测。表B.1引物序列引物名称序列(5'-3)引物名称序列(5'-3')CDV1-FGGCAGATGAGTTCTTCAAAACDV1-RCAATTCTAGGCTTGTTCCCCDV2-FGGTGTCAAGGAACAACTGGCDV2-RCTATCCCTCCTAGAGCAAACCAV-1-1-FCGTCCTCACCTAAGCCTAACAV-1-1-RAAGGTAGTAATGTTCAGCGGCAV-1-2-FATGCCGCTGAACATTACTACCAV-1-2-RGAAAGGTTAGCAGGCTTACACPV1-FACTCCAGCAGCTATGAGATCCPV1-RAGCAAATTCATCACCTGTTCCPV2-FCAGGTGATGAATTTGCTACACPV2-RCCATTTGAGTTACACCACG微阵列芯片检测探针序列、质控对照探针序列和探针排布见表B.2所示。表B.2探针序列、质控对照探针序列和探针排布探针名称缩写检测病毒序列(5'-3')CTTTCGACCCTTCGTCTACACCTATCCCTCCTAGAGCAAACAV-1-1GTGCCATTGGAGAGACAGAGCAV-1-2GAATCATACGGCATCTGGTGAACCCAATGTCTCAGATCTCATGGTAAGCCCAATGCTCTAT表面化学对照-Cy-3质控对照CACATCACTCAGTTATAGTC阴性对照NC质控对照GACCGCGCTTATACTATAGTC杂交对照质控对照CCCGCTCCGATGGGATAGTC标记对照质控对照CTCAAAAGCCCTTCCTGCCCA阳性对照质控对照GATGGTAGGATAGTGGCCTA微阵列芯片质控对照模板序列见表B.3所示。GB/T41522—2022表B.3质控对照模板序列对照名称对照序列5'-3杂交对照-GACTATCCCATCGGAGCGGG标记对照模板CACGAGGAGTCTGCTACCCGAGAAACCATATTCAGAGCGAATCATCTGTGAGCCGTTTCAGTTGGTTGGTCTCAAAAGCCCTTCCTGCCCAGAGTGATCTCACTCGTCGAGGCCATCGGCTCTGACGCGATATACGGTTGTGCCGAGTGTCAATAGTTTCAAATGAGGTAGCAGACTCCTCGTG将合成的探针用点样缓冲液(50%DMSO)溶解，浓度为50μmol/L,芯片每条探针横向重复3点，点样均匀度的标准方差约为15%。2图B.1检测矩阵在芯片上的排布芯片每个矩阵6行7列，探针排列如图B.2所示。图B.2各检测探针在矩阵中的排布点样后用0.2%SDS洗液清洗2min,用0.2%的封闭液搅拌封闭5min,再用去离子水搅拌清洗3次，最后2000r/min离心1min。将四区域芯片围栏贴于芯片表面，置于暗盒室温保存。B.2反转录反应液体系组成反转录反应液体系包含以下组成：a)总RNA(含3种病毒RNA)1μg～5μg;B.3PCR反应液体系组分对称PCR体系不对称PCR体系222Cy-3标记的下游引物(5μmol/L)11Taq酶(5U/μL)DEPC水B.4杂交反应液体系50×Denhardt's溶液配方：聚蔗糖5g,聚乙烯吡咯烷酮5g,BSA5g加水至500mL。GB/T41522—2022(规范性)微流控芯片试剂组分和存放条件见表C.1所示。序号名称存放条件1微流控芯片室温2反应液—20℃3核酸裂解液室温CPV检测引物序列见表C.2所示。表C.2CPV引物序列引物序列GTAAACCATGTAGACTAACACAGCACTATAACCAACCTCAGCCCTTCAGCTTGAGGCAAAGAATTTA-TACATGGCAAACAAATAGAGCAGGAGTTCAACAAGATAAAAGACGT-GGTCTCATAATAGTAGCTTCAGTCDV检测引物序列见表C.3所示。引物序列CGGTGGCTGAATGACATGCAAATATTCCTAGCGTCACTACGCTATAGTACATACCTTGGCTTTGG-CATTACTCCAGACAACCAACTGTTGACACTGGCTTCCTTGTG-GAATACCATCTTGTGAACCATTCAV-1检测引物序列见表C.4所示。表C.4引物序列AATAGCAGTGGGTTGTCCCTAAGTTGTTAGACAGGTTCCCCAAGCAAAGGTGCACATGA-ATAAATCTATTCAGTTGAGAAGGGTAGTTGGCAATGTTTCCCCCC-AGTGTACGGGATATTCTGTTGB/T41522—2022CPV、CDV和CAV-1三种病毒阳性质控序列见表C.5所示。表C.5阳性质控序列病原名称质控序列GTAAACCATGTAGACTAACACACACATGGCAAACAAATAGAGCATTGGGCTTACCACCATTTCTAAATTCTTTGCCTCAAGCTGAAGGAGGTACTAACTTTGGTTATATAGGAGTTCAACAAGATAAAAGACGTGGTGTAACTCAAATGGGAAATACAAACATTATTACTGAAGCTACTATTATGAGACCAGCTGAGGTTGGTTATAGTGCCGGTGGCTGAATGACATGCCATTACTCCAGACAACCAACTATATGGTCCTCCCGGAGAGTTCCAACGCCAAGGTATGTACTATAGCAGTGGGTGAGTTGACACTGGCTTCCTTGTGTGTAGATGAGAGCACCGTAGTGTTATATCATGACAGCAGTGGTCCACAAGATAGTATTCTAGTAGTGACGCTAGGAA