响应面优化微波辅助提取花椒叶山椒素及其生物活性研究

摘要以花椒叶为原料，乙醇作为溶媒，研究花椒叶山椒素微波辅助提取工艺条件，采用响应面法对工艺进行优化。以清除铁还原力、羟基自由基(•OH)能力及2,2’-联氨-双-（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二胺盐（ABTS）能力来评价体外抗氧化能力和α-淀粉酶活抑制率来评价其降血糖能力。结果表明，花椒叶山椒素最佳提取工艺条件为微波温度25℃、微波时间10min、微波功率400W、料液比1：30（g/mL）、乙醇浓度58%、在此条件下花椒叶山椒素最高提取率为5.98mg/g。花椒叶山椒素具有较强的抗氧化活性和降血糖能力，铁还原力、清除•OH自由基能力、清除ABTS自由基能力和α-淀粉酶抑制率均表现出一定的质量浓度依赖性；花椒叶山椒素铁还原力、清除清除•OH、清除ABTS自由基能力和α-淀粉酶抑制率半数有效质量浓度(IC50)分别为37.67、56.09、34.49和4.96μg/mL。花椒叶山椒素可以作为一种天然食源性抗氧化和降血糖剂。引言花椒

(Zanthoxylumbungeanum

Maxim)，是芸香科、花椒属的一种药用小灌木，其主要在四川、安徽、贵州等地生长。花椒是我国特有的一种香料，含有挥发油、多酚、山椒素等生物活性物质，具有抗肿瘤、抗氧化、抑菌和消炎等生物活性。山椒素是花椒中最具特征的一类酰胺类，是花椒麻味来源，以羟基-α-山椒素、羟基-β-山椒素和羟基-γ-山椒素为主，其具有麻醉镇痛、消炎、保护肠道等功能，但其在高温环境中很容易降解。花椒叶是花椒的主要副产物，资源丰富、产量大，为增加花椒产业的效益，迫切需要对副产物花椒叶的利用进行深入的研究。但目前，对于花椒叶的报道主要集中在其多糖、挥发油及黄酮的提取及研究，还未见对花椒叶山椒素的报道。微波是一种非离子的电磁辐射，细胞壁在电磁波作用下容易发生裂解，使胞内物质更被提取出来。为了防止高温对花椒叶山椒素的破坏，本实验建立室温微波提取花椒叶山椒素方法，以抗氧化及降血糖为模型研究其生物活性，旨在为花椒叶的深加工提供参考。正文部分1

实验部分1.1

主要仪器与试剂1.2

实验方法1.2.1

花椒叶山椒素的提取1.2.2

花椒叶山椒素的提取率1.3

单因素试验1.3.1

乙醇浓度对花椒叶山椒素提取率的影响精确称取20g花椒叶粉，分别加入400mL0%、20%、40%、60%、80%、100%

乙醇溶液（料液比1:20（g/mL），在25℃下，300W微波提取10min。1.3.2

微波时间对花椒叶山椒素提取率的影响精确称取20g花椒叶粉，加入400mL40%乙醇溶液（料液比1:20（g/mL）），在25℃下，300W微波分别提取5、10、15、20、25、30min。1.3.3

微波功率对花椒叶山椒素提取率的影响精确称取20g花椒叶粉，加入400mL40%乙醇溶液（料液比1:20（g/mL）），在25℃下，分别在0、100、200、300、400和500W微波提取10min。1.3.4

料液比对花椒叶山椒素提取率的影响精确称取20g花椒叶粉，分别以料液比1∶10、1∶15、1∶20、1∶25和1∶30（g/mL）的比例加入40%乙醇溶液，在50℃下，300W微波分别提取10min。1.4

响应面优化实验依据单因素实验，采用Box-Behnken响应面法，将乙醇浓度、微波时间和微波功率设为自变量，花椒叶山椒素提取率设响应值，进行3因素3水平实验设计，每个因素和水平实验均重复3次。优化实验因素水平见表1。1.5

花椒叶山椒素抗氧化能力测定以铁还原力、•OH自由基清除能力和ABTS自由基清除能力模型来评价花椒叶山椒素抗氧化能力，以同等质量浓度的VC溶液作为对照品。1.6

花椒叶山椒素降血糖能力测定评价花椒叶山椒素降血糖能力，以同等质量浓度的二甲双胍溶液作为对照品。

2

结果与讨论2.1

单因素实验结果2.1.1

乙醇浓度对花椒叶山椒素提取率的影响如图1所示，花椒叶山椒素提取率随着乙醇浓度的升高呈现出先升高后降低的趋势。2.1.2

微波时间对花椒叶山椒素提取率的影响如图2所示，随着微波时间的升高，花椒叶山椒素提取率呈先升高后降低的趋势。2.1.3

微波功率对花椒叶山椒素提取率的影响微波可以产生很高的辐照能量，促进溶媒对植物细胞的穿透能力。此外，微波还能形成磁场可促进物质与溶媒之间的相互作用，微波可以使细胞壁破裂和增加物质的溶解度，也可显著提高提取物的扩散速率。如图3所示，随着微波功率升高，花椒叶山椒素提取率也逐渐升高，当微波功率达到400W时，山椒素提取率最高。2.1.4

料液比对花椒叶山椒素提取率的影响由图4可知，花椒叶山椒素提取率随着料液比的增大呈现出先增大后降低的趋势，当料液比为1∶20（g/mL）时，山椒素提取率达到最大。2.2

响应面优化实验结果2.2.1

响应面优化设计实验结果及方差分析利用DesignExpert8.0软件对表2中的实验数据进行回归拟合分析和方差分析2.2.2

各因素之间的交互作用微波功率、微波时间和乙醇浓度三者之间交互作用可依据等高线曲面的陡度及等高线的形状来判定交互作用是否显著，如图5所示。2.2.3

响应面模型验证由上述回归拟合方程可以得到最佳花椒叶山椒素提取工艺参数结果为：微波功率402.57W、微波时间10.01min、乙醇浓度58.40%，在此条件下花椒叶山椒素提取率为6.04mg/g。2.3

花椒叶山椒素抗氧化能力测定2.3.1

铁还原力测定铁还原力是最常用的抗氧化活性的方法，可以直接反应总抗氧化能力的大小。由图6可知，相同浓度下花椒叶山椒素的抗氧化能力不及VC。2.3.2

•OH自由基清除力测定由图7可知，当浓度低于100μg/mL时，相同浓度下花椒叶山椒素的抗氧化能力不及VC。花椒叶山椒素浓度达到100μg/mL时，铁还原力达到最大，为86.11%，此浓度与80μg/mL的VC抗氧化能力相当，表明花椒叶山椒素具有较强的抗氧化能力。2.3.3

ABTS自由基清除力测定ABTS自由基清除力基于抗氧化剂可提供电子或氢原子灭活自由基，导致ABTS溶液颜色发生变化的一种方法，常用于抗氧化能力的测定。由图8可知，相同浓度下花椒叶山椒素的抗氧化能力不及VC。2.4

花椒叶山椒素降血糖能力测定α-淀粉酶是人体中消化淀粉等糖类化合物的关键酶，抑制酶活可以减少分解淀粉等糖类化合物成单糖，从而达到饭后血糖的降低。由图9可知，相同浓度下花椒叶山椒素的α-淀粉酶抑制率均低于二甲双胍。3

结论结论本实验以花椒叶为原料，乙醇作为溶媒，通过单因素实验考察了微波时间、微波功率、料液比和乙醇浓度对花椒叶山椒素的微波提取的影响，选择乙醇浓度、微波时间和微波功率3个因素进行响应面优化花椒叶山椒素微波辅助提取工艺条件，最终得到最佳的花椒叶山椒素微波辅助提取工艺条件为微波温度25℃、微波时间10min、微波功率400W、料液比1：30（g/mL）、乙醇浓度58%，在此条件下花椒叶山椒素最高提取率为5.98mg/g。采用了3种体外抗氧化模型（铁还原力模型、•OH自由基清除力模型及ABTS清除力模型）和体外α-淀粉酶抑制率来评价花椒叶山椒素的抗氧化能力和抗糖化能力。表明花椒叶山椒素具有较强的抗氧化活性和降血糖能力，铁还原力、清除•OH自由基能力、清除ABTS自由基能力及α-淀粉酶抑制