应用指南 - 利用CTS AAV-MAX生产系统在DynaDrive一次性生物反应器中生产1000L规模的AAV

应用说明|CTSAAV-MAX系统和DynaDr随着临床和商业阶段腺相关病毒（AAV先前的研究已经证明了Gibco™CTS™AAV-MAX无辅助AAV生产系统在Thermo™作为该项研究的进一步延续，本研究介绍了如何在5000LDynaDriveS.U.B.中将相同的工艺放大到1000L工作体积的商业生产规模，以及如何在此规模下成功实现这些工Theworldleaderinservingscience材料和方法CTS病毒生产细胞2.0培养物在整个种子培养和生物反应器中，将Gibco™CTS™病毒生产细™积为10L，3天后将其扩增到50L的全工作体积。当6胞/毫升（VC/mL）用于生产运行。为了制备转染用培养CTSVPC2.0在接种后24小时内培养至目标密度至少3.0×106 过程中，对照培养物在摇瓶中生长。测定生长动力学、代谢参数和病毒基因组滴度，并与相应的生物反应器数据进行比较。66CTSAAV-MAXCTS病毒生产细胞2.0CTS病毒生产培养基2（BPC）生物反应器中培养物的转染表3列出了转染900L培养液所需试剂的建议用量。转染试剂和质粒DNA络合前，所有试剂均在4-8℃下保存。将转移质粒™BPC（放置桶中）中，温度为4-8℃。另外，™CTS™通过脚轮左右移动Productainer菌焊接到5000L生物反应器上，在室温下进行孵育，无需进一步搅拌。孵育20分钟后，使用无菌Levitronix™一次性泵以约11L/min的速度将溶液输送到生物反应器中。在9分钟内将复增强剂的BPC无菌焊接到生物反应器上，并将增强剂加入到系待转染的培养物体积Viral-Plex络合缓冲液为方便下游分析，在收获当天，即转染后约72小时，从生物反™™™以消化任何非衣壳化核酸，然后启动搅拌，并在37℃温度下孵育2小时，不通气。然后从反应器中取样进行病毒滴度分析。转染效率、病毒基因组滴度和感染性滴度的量化荧光细胞计数和总细胞计数来定量转染效率。转染24小时后测在收获前和收获时的不同时间点取样并冷冻于-80℃下，使用靶向GFP基因序列的引物和探针，通过液滴数字PCR（ddPCR）以去除非衣壳化DNA。核酸酶处理后，使用每个样本的连续稀通过转导HT1080细胞来测定病毒感染性滴度。将HT1080细胞与离心后裂解液上清的连续稀释液在37℃下培养过夜，对感染滴度进行定量。采用流式细胞术检测GFP。通过总衣壳ELISA和ddPCR对完整衣壳的百分比进行定量。ddPCR滴度总衣壳总衣壳每天采集样本以评估细胞的生长速率和健康状况。从生物反应器中取出约15mL并弃去，以冲洗取样管路。然后采集新的2022、营养和代谢物水平。使和细胞活力与对照摇瓶获得的细胞密度和细胞活力相当（图1）。在整个生产过程中，生物反应器和对照摇瓶产生的葡萄糖、乳酸盐和氨水平相当活细胞密度(×10cells/mL）9876543210–1–0.500.511.522.5310090807060504030200细胞活力（%）工艺时间（天）对照摇瓶的平均VCD5000LDynaDriveS.U.B.的VCD 对照摇瓶的平均细胞活力5000LDynaDriveS.U.B.的细胞活力葡萄糖浓度（g/L）4.54.03.53.02.52.00.50.0葡萄糖浓度（g/L）4.54.03.53.02.52.00.50.0–1–0.500.511.522.53工艺时间（天）对照摇瓶的平均值5,000LDynaDriveS.U.B.图2.125mL摇瓶和5000LDynaDriveS.U.B.在1000L工作体积下生产AAV6-GFP时，CTS病毒生产细胞2.0的葡萄糖浓度曲线乳酸盐浓度（g/L）0.20.033工艺时间（天）对照摇瓶的平均值5,000LDy图3.125mL摇瓶和5000LDynaDriveS.U.B.在1000L工作体积下生产AAV6-GFP时，CTS病毒生产细胞2.0的乳酸盐浓度曲线对照摇瓶的平均值5,000LDynaDriveS.U.B.图4.125mL摇瓶和5000LDynaDriveS.U.B.在1000L工作AAV6-GFP时，CTS病毒生产细胞2.0的氨浓度曲线瓶的转染效率相当。图6和图7中的基因组滴度和感染性滴度结果反映出了这一点。生产运行和平均对照摇瓶的完整衣壳百分比也相当（图8）。903005,000LDynaDriveS.U.B.率05,000LDynaDriveS.U.B.生产AAV6-GFP时，CTS病毒生产细胞2.感染性滴度（TU/mL）05,000LDynaDriveS.U.B.对照摇瓶的平均值生产AAV6-GFP时，CTS病毒生产细胞2.09080完整衣壳（%）完整衣壳（%）60504030205,000LDynaDriveS.U.B.对照摇瓶的平均值生产AAV6-GFP时，CTS病毒容器、耗材和操作空间，从而降低了种子细胞生产流程的复杂性。它还可通过减少连接数量和转移损失，来提高种子培养本身的效率。测试的气流和搅拌速率能实现充分的O2传质，从而维持所需的DO设定值，而不会对细胞造成剪切损伤或产生过多泡沫。可扩展性，可满足基因治疗研究人员当前和未来的需求。1000L工作体积一次性生物反应器的操作规程及种子细1.亚培养和扩增CTS病毒生产细胞2.0(VPC2.0)，直至其密度达到4x106至6x106个活细胞/毫升（VC/mL），结合培养体积，细胞总数达到3x109至6x109，接种到50LDynaDriveS.U.B.或ThermoScientific™HyPerforma™5:1S.U.B.，工作体积为10L。这将产生0.3x106或0.6x106VC/mL的起始密度，具体取决于进行4天还是3天传代。注：在转染前，解冻细胞至少复苏3代。HyPerforma5:1S.U.B.：a.接种前两天，将BPC装载到硬件中，并夹紧未使用的所b.向S.U.B.注入培养基之前，可根据需要用N2或空气吹扫BPC。则需要准备可高温高压灭菌电极，通过灭菌套管对电极进行高压灭菌，并在添加培养基前将其插入S.U.B.。d.接种前一天，在S.U.B中加入8LCTS病毒生产培养基e.开启S.U.B的搅拌功能，加热至37°C，同时向系统中注入N2。预热反应器且DO读数稳定后，开始校准DOf.校准DO电极后，打开运行级联回路以平衡系统，并抽取离线样品以检查pH校准。如果使用一次性pH电极，则将校准信息输入控制器，然后根据需要执行单点偏移3.当摇瓶中细胞密度达到4x106至6x106VC/mL时，对步骤1中准备的DynaDriveS.U.B.或HyPerforma5:1S.U.B.进行接种，加入CTSVPC2.0，使最终密度为0.3x106或0.6x106VC/mL（分别用于4天或3天传代最终工作体积为10L，得到N-3培养物。N-3反应器的设定值见表4。表4.50LS.U.B.中N-3培养物的建议设定值LHyPerforma5:1DynaDriveS.U.B.中S.U.B.中37°C±0.537°C±0.54.28in.4.37in.40%（用0-0.25slpm空气和0-1slpmO2控40%（用0-1slpmO2控pHCO2控制）CO2控制）4.当细胞密度达到4×106至6×106VC/mL时，向培养物中加入新鲜的CTSVPM，使工作体积达到50L，使4天或3天传代的细胞密度分别达到0.3×106VC/mL或0.6×106VC/mL。这将是N-2培养。按表5调整反应器的设定值。表5.50LS.U.B.中N-2培养物的建议设定值LHyPerforma5:1DynaDriveS.U.B.中S.U.B.中37°C±0.537°C±0.550L50L4.28in.4.37in.40%（用0-0.25slpm空气和0-1slpmO2控制）40%（用0-1.5slpmO2pHCO2控制）CO2控制）7/aavmax/dynadrive5.在接种N-1和N培养物之前，按以下步骤准备3000L或a.接种前两天，将BPC装载到硬件中，并夹紧未使用的所b.向S.U.B.注入培养基之前，可根据需要用N2或空气吹扫BPC。则需要准备可高温高压灭菌电极，通过灭菌套管对电极进行高压灭菌，，并在添加培养基前将其插入S.U.B.。d.接种前一天，在S.U.B中加入250LCTe.开启S.U.B的搅拌功能，加热至37°C，同时向系统中2。预热反应器且DO读数稳定后，开始校准DOf.校准DO电极后，打开运行级联回路以平衡系统，并抽则将校准信息输入控制器，然后根据需要执行单点偏移S.U.B.进行接种，加入CTSVPC2.0，使最终密度为0.3x），注：本种子细胞扩增方案（步骤1-6）只是一扩增到大规模生物反应器中的示例，可根据您的工艺进行必