应用指南 - 使用CTS Rotea逆流离心系统高流速洗涤和浓缩T细胞

利用CTSRotea系统以高流速处理细胞前，必须考虑几个重要参数以保证结果成功和一致•CTS免疫细胞SR•用或不用CTSDPBSCellCellinput0mLWashbufer100mLBWaste0mLAFinalFinalproduct图1.用于高流速T细胞洗涤和浓缩的CTSRotea一次性Theworldleaderinservingsciencegibco2材料和方法过CTSRotea系统从新鲜的leukopak袋中分离出PBMC。PBMC经冻存、洗涤，然后使用Gibco™CTS™Dynabeads™CD3/CD28磁珠活化PBMC。在添加了Gibco™CTS™免疫细胞血清剂和IL-2的Gibco™CTS™OpTmizer™T细胞扩增无血清培养基™™200™自动细胞计数仪评价T细胞回收率和活性。采用后的T细胞以监测其扩增和活性。2.75×106个细胞/mL-5.2×106个细胞/mL且细胞计数为1.0×9的条件下扩增细胞9-15天。在整个培养期间监测T细用CTSRotea系统处理后的细胞回收率大于95%，细胞活性略有改善（图2A）。对其中一次运行的细胞进行培养，以6扩增至6ABC80604020095989592InputFinalRecoveryviabilityviabilityVL1-HVL1-H::CD8-eFluor450-HBeforeprocessingVL1-HVL1-H::CD8-eFluor450-H46.2Q2Q48.540Q48.540Q3Q344.01010101010RL1-H::CD4-APC-HAfterprocessing46.946.9Q2Q48.460Q48.460Q3Q343.510101010RL1-H::CD4-APC-H在CTSRotea系统上成功运行需要形成稳定的细胞床。当初始细99848487806040200图3.起始浓度对细胞回收率的影响。T细胞回收率和活性也受到使用CTSRotea系统洗涤和浓缩之前的培养期持续时间的影响。回收率和活性的差异取决于T细胞的929984579-15Durationofculturing(da图4.培养和扩增持续时间对细胞回收率的影响0.4x10to0.9x10cells/mLto2.3x100.4x10to0.9x10cells/mLto2.3x10cells/mL2.5x10to5.2x10cells/mL806040020345A至B67A至E,F0–8J至K9J至K建立细胞床建立细胞床体积浓缩细胞床以进行洗涤J至K浓缩细胞床以进行回收J至KK至J4999悬浮培养基密度与细胞洗涤和收集所用的培养基密度之间的差异发生该现象。如果培养基密度发生变化，在洗涤步骤期间增加CF比率并加入洗涤暂停循环可能会有所帮助。如果在与悬浮培养基两次运行，用培养基或DPBS洗涤细胞后，未观察到回收率差异(9使用高流速方案或手动方案洗涤和浓缩后的T细胞扩增速率比较见图7。第0天解冻PBMC，然后将CTSDynabeadsCD3/CD28磁珠与T细胞按3:1混合，用混合物活化PBMC。第5天采用™80604004.0x103.0x104.0x103.0x102.0x10to2.5x106449图5.每个循环的细胞起始量对回收率的影响。CulturemediumDPBS80CulturemediumDPBS806040200CulturemediumDPBSCulturemediumDPBS80604020092723.52.50.532.82.211CTSRoteasystemManual图7.使用CTSRotea系统洗涤的细胞和手动洗涤的细胞的扩增倍数。养持续时间和洗涤培养基等因素对获得良好结果至关重要。重要对较低的CF比率限制了可上样到逆流离心（CFC）腔中的细胞数扩增持续时间和洗涤培养基的类型可显著影响细胞回收率。但这™一次性管路套件使用户能自由设计多种具有不同流速、细胞总数为了消除可能影响建立稳定细胞床的变异性，使用如果细胞处于扩增早期（第3-7天考虑增加CF比率。这一点通常可以通过降低CTS免疫细胞SR