NYT 2258-2012 香蕉黑条叶斑病原菌分子检测技术规范

香蕉黑条叶斑病原菌分子检测技术规范中华人民共和国农业部发布I1香蕉黑条叶斑病原菌分子检测技术规范1范围本标准规定了香蕉黑条叶斑病原菌(MycosphaerellafijiensisMorel本标准适用于香蕉种苗及大田植株上的黑条叶斑病原菌的定性检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所的修改单)适用于本文件。SN/T1193基因分析检测实验室技术要求3术语和定义下列术语和定义适用于本文件香蕉黑条叶斑病bananablackleatstreakdisease由斐济球腔菌(Mycosphaerellaen.isMorelet)引起的一种为害香蕉叶甘的检疫性真菌病害。该病害病原菌的分类地位寄主范围、地理分布及其为害症状见A4、A.6、A7和A.8。真核生物核糖体基因内转录间隔区(rDNA-ITS声通常包括ITSI.5.8S和Ys2聚合酶链式反应polymerasechainreaction,PCR模板基因序列先经高温变性成为单链，在DNA聚合酶作用和适宜的反应条件下，根据模板序列设计的两条引物分别与模板DNA两条链土相应的一段互补序列发生退火而互相结合，接着在DNA聚合酶的作用下以四种脱氧核糖核酸(dNTP)为底物，使引物得以延伸，然后不断重复变性、退火和延伸这一循环，使欲扩增的基因片段以几何倍数扩增。根据香蕉黑条叶斑病原菌核糖体基因内转录间隔区(rDNA-ITS)特有碱基序列设计特异性引物进行PCR扩增。依据是否扩增获得预期1009bp的DNA片段，判断样品中是否携带香蕉黑条叶斑病原菌。5仪器设备及试剂按附录A描述的症状仔细检查香蕉叶片，发现香蕉黑条叶斑病疑似症状，即取叶片200g以上，装7显微观察从疑似病样病斑上挑取或用透明胶粘取灰色霉状物制成临时玻片进行镜检，观察有无类似斐济球28PCR检测见B.4.1。引物名称引物序列见B.4.3。3NY/T2258—2012经检测确定携带香蕉黑条叶斑病原菌的阳性样品经液氮干燥后，于一70℃以下保存30d以备复4ercosporafijiensis(Morelet)Deithton。5A.9传播途径6B.2.11mol/LTriB.2.31mol/LEDTA-Na₂(pH8.0)称取372.2g乙二铵四乙酸二钠(EDTA-Na₂),溶解于70mL超纯水中，再加入适量NaOH溶液称取81.9g氯化钠(NaCl)溶解于800mL超纯水中，缓慢加入20g十六烷基三甲基溴化铵10mL超纯水中；称取50.0g蔗糖溶解于30mL超纯水中。混合以上3种溶液，加超纯水定容至710×PCR缓冲液(Mg²+Plus)、dNTP(2.5mmol/L)、Taq聚合酶(5U/μL)、特异性引物对(20B.3PDA培养基后，于65℃水浴30min。离心(14000×g,10min);取上清，加入等体积Tris饱和酚(pH≥7.8):氯仿：异戊醇(25:24:1),充分混匀，离心(14000×g,10min);取上清，加入2