粗蛋白质之定量法学习课件

粗蛋白酸分解2024/7/23粗蛋白質之定量12024/7/23粗蛋白質之定量2蛋白質測定的方法測定蛋白質的方法很多，一般是根據蛋白質的理化特性來進行定量的方法，這些方法可分為兩大類：一類是利用蛋白質的物理化學性質即含氮量、肽鍵和折射率等測定蛋白質含量如折射率、比重、紫外吸收等測定得知，另一類是利用化學方法測定蛋白質含量利用蛋白質中特定胺基酸殘基、酸、鹼性基因和芳香基團等測定蛋白質含量。如微量凱氏定氮、雙縮脲反應、Folin-phenol試劑法(又名Lowrymethod)。但因食品種類繁多，食品中蛋白質含量各異，特別是其他成分，如碳水化合物、脂肪和維生素等干擾成分很多，因此蛋白質的測定通常利用凱氏定氮法是由樣品消化成銨鹽蒸餾，用標準酸液吸收，用標準酸或鹼液滴定，由樣品中含氮量計算出蛋白質的含量。2024/7/23粗蛋白質之定量3凱氏定氮法此法是1883年Kjeldahl發明，當時凱氏只使用H2SO4來分解試樣，來定量穀物中的蛋白質，他只知用H2SO4分解試樣，而不能闡明H2SO4分解有機氮化合物生成氨的反應歷程，所以只使用H2SO4分解試樣，需要較長時間。JohanGustavChristofferThorsagerKjeldahl(1849–1900)Gunning改進的辦法是在消化時加入K2SO4使沸點上升，這樣加快分解速度，因為溫度由原來硫酸沸點的380℃上升到400℃，凱氏定氮法至今仍在使用。由於食品中蛋白質含量不同，，凱氏法分為：凱氏定氮常量法、半微量法和微量法，但它們的基本原理都是一樣的。凱氏法是測定總有機氮的最準確和操作較簡便的方法之一。

2024/7/23粗蛋白質之定量4實驗目的：了解物質中蛋白質含量的測定方法分解裝置的操作學習了解各種凱氏定氮蒸餾裝置的操作練習掌握凱氏定氮法的原理和操作技術2024/7/23粗蛋白質之定量5凱氏定氮法凱氏常量定氮法：

由於食品中蛋白質含量不同又分為凱氏定氮常量法、半微量法和微量法，但它們的基本原理都是一樣的。步驟如下：(1)消化：將含氮試料，以濃硫酸加熱分解成為無機的硫酸銨(2)蒸餾：樣液中的硫酸銨在鹼性條件下釋放出氨，在這操作中，一是加入氫氧化鈉溶液要過量，二是要防止樣液中氨氣逸出。(3)吸收：以水蒸汽在鹼性下，將氨蒸餾出來，同時以稀硫酸吸收(4)滴定：

蒸餾過程中放出的氨可用一定量的標準硫酸或標準鹽酸溶液進行氨的吸收，然後再用標準氫氧化鈉溶液反滴定過剩的硫酸或鹽酸溶液，從而計算出總氮量。(5)計算2024/7/23粗蛋白質之定量6氮的來源生物體含氮化合物蛋白質少量的非蛋白質的含氮部分醯胺化合物生物鹼含氮類脂色素卟啉含氮碳水化合物(胺醣)核酸、嘌呤、嘧啶及肌酸(creatine)等皆為含氮物質非蛋白態胺基酸(游離胺基酸)及尿素循環之胺基酸(瓜胺酸citrulline和鳥胺酸Ornithine)三聚氰胺我們在檢驗食品中蛋白質時，往往只限於測定總氮量，然後乘以蛋白質核算等數，得到蛋白質含量，實際上包括核酸、生物鹼、含氮類脂、卟啉和含氮色素等非蛋白質氮化合物，故稱為粗蛋白質量(crudeprotein)2024/7/23粗蛋白質之定量7將含氮試料，以濃硫酸加熱分解成為無機的硫酸銨其次將銨離子（NH4+）以鹼中和成為氨以水蒸汽在鹼性下，將氨蒸餾出來，同時以稀硫酸吸收最後滴定稀硫酸的殘餘硫酸，可以求得含氮量再乘以該試樣之氮係數，所得之值稱為粗蛋白質量(crudeprotein)。原理Acid2024/7/23粗蛋白質之定量8消化(分解)樣品與硫酸一起加熱消化，硫酸使有機物脫水。並破壞有機物，使有機物中的C、H氧化為CO2和H2O蒸汽逸出，而蛋白質先分解為胺基酸，再分解為氮，則與硫酸結合成硫酸銨(NH4)2SO4

，留在酸性溶液中2024/7/23粗蛋白質之定量9蒸餾吸收因分解液中除了硫酸銨外，尚含有很多其他分解物質，所以蒸餾分解液時，須添加氫氧化鈉(NaOH)，使其在鹼性條件下游離出氨氣(NH3)，以供稀酸吸收成硫酸銨而留在吸收液中，方程式如下：2024/7/23粗蛋白質之定量10滴定游離出來之氨以定量之稀硫酸中和吸收，再度產生純的(NH4)2SO4，未與氨中和之剩餘稀硫酸則以定濃度之氫氧化鈉滴定至中性。最後由氫氧化鈉之滴定量，可得知被中和之稀硫酸量，進而換算出試料之總含氮量(totalnitrogen)。再乘以該試樣品之氮係數，所得之值稱為粗蛋白質量(crudeprotein)。2024/7/23粗蛋白質之定量11粗蛋白質之定量法器材及藥品器材：分析天平燒杯六孔及三孔電熱包MULTI-UNITMantleheater量筒分解瓶蒸餾裝定容瓶250ml球型吸管20ml球型吸管10ml三角瓶滴定管滴管濾紙蒸餾裝置：玻璃安全管橡皮管廢液管蒸餾瓶直示冷凝管鐵架石綿心網管路夾(3-4支)平或圓底燒瓶橡皮塞玻璃彎管2024/7/23粗蛋白質之定量12粗蛋白質之定量法--藥品：濃硫酸（36N）：不可含(NH4)2SO4分解促進劑CuSO4：K2SO4=1：9取10gCuSO4加90gK2SO4混合（以固態混合用研砵磨碎）30％NaOH取30gNaOH加入70mlH2O攪拌溶解0.1NH2SO4(吸收液)取0.69ml36NH2SO4用水定容至250ml（※硫酸加入水中）吸收液有：A.0.05NH2SO4

用標準鹼返滴定，甲醛紅指示劑B.硼酸

目前都用硼酸吸收液，用硼酸代替H2SO4，這樣可省略了反滴定，H2SO4是強酸，要求較嚴，而硼酸是弱酸，在滴定時，不影響指示劑變色範圍，另外硼酸為吸收液濃度在3%以上可將氨完全吸收，為保險期間一般用4%。用HCl進行滴定，混合指示劑2024/7/23粗蛋白質之定量13粗蛋白質之定量法--藥品0.2N氯化鋇(BaCl2)：秤取2.0克之BaCl2．2H2O，加蒸餾水溶解並稀釋至100ml。鄰苯二甲酸氫鉀標準試藥(Potassiumacid,phthalate;KHP)秤取約1克之KHC8H4O4於秤量瓶中，置於105℃之電氣恒溫箱中乾燥2小時，然後取出移至乾燥器中放冷至室溫備用。0.1NNaOH（需標定）稱取4.17克之NaOH(純度96%)，溶入100ml除去CO2之蒸餾水，次加10ml之0.2NBaCl2，再以除去CO2

之蒸餾水稀釋至1000ml，然後充分振盪混合後放置1小時。1小時後澄清液小心移入細口瓶中，含有Na2CO3沈澱物之底層混濁溶液再以濾紙進行過濾，濾後一併移入細口瓶中，瓶口以橡皮塞封閉。2024/7/23粗蛋白質之定量140.1NNaOH標定：以50ml之燒杯正確秤取約0.4085克已乾燥之KHC8H4O4再用50ml除去CO2

之蒸餾水分次將KHC8H4O4洗入250ml之三角瓶中溶解後加入2~3滴酚酞指示劑然後用已裝好0.1NNaOH溶液的滴定管進行滴定至被滴定溶液(KHC8H4O4)呈淺紅色時(30秒不腿色)即為滴定終點(到達化學計量點時，溶液呈弱鹼性，可用酚酞做指示劑)空白試驗以50ml除去CO2

之蒸餾水同時進行空白試驗(步驟2-6)2024/7/23粗蛋白質之定量15氫氧化鈉溶液實際濃度及其力價之計算：KHC8H4O4+NaOH→KNaHC8H4O4+H2O2024/7/23粗蛋白質之定量16實驗資料記錄：

測定次數空白第一次第二次第三次鄰苯二甲酸氫鉀(g)

0NaOH溶液終讀數(mL

)NaOH溶液初讀數(mL)V（NaOH）(mL)c（NaOH）(mol·L-1)c（NaOH）平均值(mol·L-1)相對平均偏差1.

用鄰苯二甲酸氫鉀標定氫氧化鈉溶液時，為什麼用酚酞作指示劑而不用甲基紅或甲基橙作指示劑？

2.

標定時用鄰苯二甲酸氫鉀比用草酸有什麼好處？2024/7/23粗蛋白質之定量17藥品8.酚酞指示劑取1g酚酞加95％酒精100ml9.混合指示劑甲基紅(methylred)為飽和的溶液亞甲基藍(methyleneblue)取0.1g加95％酒精80ml溶解之。甲基紅：亞甲基藍＝2：1混合即為混合指示劑(紫紅色)。甲基紅：酸→紅、鹼→黃亞甲基藍：酸→藍、鹼→綠混合指示劑在鹼性溶液中呈綠色，在中性溶液中呈灰色，在酸性溶液中呈紅色如果沒有溴甲酚綠，可單獨使用0.1%甲醛紅乙醇溶液。若有些配法是以甲基紅：亞甲基藍＝0.2g：0.1g配製，配藥時因甲基紅不易溶解，剛配好時本指示劑加在酸中不會呈紫紅色，待甲基紅溶解時此劑才會呈紫紅色，而非藥品配錯。2024/7/23粗蛋白質之定量18國立高雄海洋科技大學水產食品科學系藥品室

實驗藥品需求表使用人陳文傑使用日期實驗名稱粗蛋白質之定量法班級品名規格數量備註濃硫酸（36N）100mL亞甲基藍Methyleneblue100mgNaOH(Sodiumhydroxide)200gCuSO450g甲基紅(methylred，MR)200mg95%酒精alcohol200mL鄰苯二甲酸氫鉀potassiumacidphthalate10gK2SO4450g酚酞phenolphthalein1g氯化鋇(BaCl2)30g2024/7/23粗蛋白質之定量19操作方法一、樣品的處理二、消化三、定氮儀的構造和安裝四、蒸餾五、滴定六、計算2024/7/23粗蛋白質之定量20精稱0.5g魚肉（細碎）於秤藥紙上；空白為0.5mL蒸餾水用秤藥紙包裹後放入分解瓶用秤藥紙取5g分解促進劑放入分解瓶中(秤藥紙不放入)加入10ml濃硫酸在抽氣櫃中的電熱爐上加熱分解（300℃）待內容物全部炭化，泡沫完全停止後，加強火力，並保持瓶內液體微沸，至液體呈藍綠色澄清透明後，再繼續加熱30分鐘（黑色→褐色→黃色→綠色）※注意勿使分解瓶乾涸，必要時可追加H2SO4但需放冷後再加分解完後放冷定容至250mL先加少量的水於分解瓶中，然後將稀釋後的分解液移至定容瓶中，（儘可能冷卻）用蒸餾水洗分解瓶，倒入250mL定容瓶中，重覆三次魚肉供試液＊空白供試液的製作與魚肉供試液的相同，分解瓶中只有秤藥紙及5g的分解促進劑分解2024/7/23粗蛋白質之定量21多孔爐(分解爐)操作六孔爐之每個電熱包各有比例式電壓控制器無段式控制器之0位置表示電源切斷位置控制器往右轉為加熱，由加熱指示燈亮表示加熱中使用時確認電源電壓為110V勿將水或溶液倒入電熱包，影響電熱包壽命。新電熱包第一次使用，表面水分及臘質等成分受，熱會蒸發，且其纖維布表面變黑，經過20至30分鐘蒸發，其表面還原白色(只有第一次使用會有此現象)電熱包其內部表面溫度約450℃左右，使用中請小心以防燙傷。2024/7/23粗蛋白質之定量22三、定氮儀的構造和安裝(氮蒸餾裝置圖)A：蒸氣產生瓶B：廢液瓶(氣液分離瓶)C：蒸餾燒瓶(二重玻璃)D：冷凝管 E：三角瓶 F：樣品注入口 G：冷凝水入口H：冷凝水出口 →蒸汽行進方向 蒸汽和氨氣行進方向凱氏定氮儀由蒸汽發生器、蒸餾燒瓶、冷凝管三部分組成

2024/7/23粗蛋白質之定量23蒸餾裝置洗滌：蒸餾裝置應先經一般洗滌，再經水蒸汽洗滌。目的在於洗去冷凝管中可能殘留的氨。對於處於使用狀態的儀器（正在測定中的儀器）加樣前使蒸汽通過1～2min即可對於較長時間未使用的儀器，必須用水蒸汽洗滌到吸收蒸汽的硼酸-指示劑混合液中指示劑的顏色合格為止。2024/7/23粗蛋白質之定量24蒸餾裝置洗滌：打開夾子1，關閉夾子2,3,4蒸餾瓶內加入30mL蒸餾水以本生灯或加熱包加熱蒸汽發生瓶(內裝八分滿的酸化水)

，使其產生水蒸汽蒸汽發生瓶內須放有沸石(Boilingstone)或毛細管以防止突沸。冷凝管通入冷凝水，冷凝管下端放一50ml之量筒作為受器。調整加熱火源，使冷凝管餾出液達每分鐘約8ml左右。冷凝管下端放置內裝100ml蒸餾水之受瓶繼續以蒸汽清洗整個蒸餾裝置，直至蒸餾瓶內之水溶液達三分之一滿時先移開火源，關夾子1此時，蒸餾瓶之洗液和受瓶內之蒸餾水會分別進入廢液瓶中，亦會開夾子2使排出廢液，此即完成一次洗滌操作。重覆1~5之操作，再行洗滌1~2次2024/7/23粗蛋白質之定量25移開火源，關夾子1,2，開4(若有)以10ml之球型吸管吸取10.0ml之0.1NH2SO4溶液注入250ml三角瓶內，並加入混合指示劑2~3滴，該三角瓶置於冷凝管出口作為受瓶，冷凝管之出口必須浸入三角瓶內之硫酸溶液中。打開夾子3，以20ml球型吸管吸取供試液20ml，由F(漏斗)處注入蒸餾瓶內，並以少量蒸餾水沖洗漏斗，其次再加入10ml之30%NaOH，亦以蒸餾水沖洗漏斗，然後關閉夾子3(可先加入2~3滴酚酞指示劑，以觀察溶液是否呈鹼性)。打開夾子1，並將火源放回蒸汽發生瓶下開始加熱使蒸汽進入蒸餾瓶。蒸餾時間約7分鐘左右。受瓶應吸收50~60ml之餾出液。供試液之蒸餾-12024/7/23粗蛋白質之定量26供試液之蒸餾-1蒸餾操作完了前，將冷凝管尖端提出受瓶液面，使蒸氣沖洗約1分鐘，用水淋洗冷凝管尖端後停止蒸餾，洗液一併沖入受瓶，此時仍在進行蒸餾中，此舉可使冷卻器之管中液體流至受瓶中。移開受瓶關本生灯夾住夾子1，使廢液逆流至廢液管，然後打開活栓使廢液溜出，此即完成一次蒸餾操作。如欲繼續蒸餾第二種試液，則蒸餾裝置必須重新以蒸汽洗過，才能進行蒸餾操作。※注意冷凝管出口需浸於0.1NH2SO4中蒸汽不可太強.而來不及冷凝2024/7/23粗蛋白質之定量27其他形式之微量凱氏定氮儀的構造和安裝凱氏定氮儀由蒸汽發生器、反應室、冷凝管三部分組成(見下圖)。蒸汽發生器包括一個電爐(1)及一個3～5升容積的燒瓶(2).蒸汽發生器借橡皮管(4)與反應室相連。反應室上邊有二個小燒杯，一個叫加樣口(7)上面有棒狀玻塞(11)供加樣用；一個叫鹼液室(5)盛放液。樣品和鹼液由此可直接到反應室(6)中。反應室中心有一長玻璃管，其上端通到反應室外層，下端靠近反應室的底部。反應室外殼下端底部有一開口，連有橡皮管和管夾(12)，由此放出反應廢液。反應所產生的氨可通過反應室上端氣液分離器(8)經冷凝管(9)通入收集瓶(10)中。反應室與冷凝管之間由橡皮管相連。2024/7/23粗蛋白質之定量28其他形式之微量凱氏定氮儀的構造和安裝1.電爐2.蒸氣發生器3.安全管4.橡皮管5.鹼液室6.反應室7.加樣口8..安全管9.冷凝管10.接受瓶11.棒狀玻塞12.夾子2024/7/23粗蛋白質之定量29其他形式之微量凱氏定氮儀的構造2024/7/23粗蛋白質之定量30蒸餾液之滴定蒸餾液↓以0.1NNaOH滴定滴定終點為淡綠色↓計算2024/7/23粗蛋白質之定量31結果與計算a：試料供試液之滴定值b：對照試驗之滴定值F：0.1NNaOH之力價註：1ml之0.1NNaOH溶液相當於1.4mg的氮。本方法的允許差：蛋白質含量小於1%時，同樣品兩次測定值之差，不得超過兩次測定平均值的10%，蛋白質含量大或等於1%時，每100g樣品兩次測定值之差，不得超過0.5g。這種計算方法是按食物總氮全部以蛋白質的形式存在而計算的，對含非蛋白氮高的食物來說，蛋白質的計算的值無疑過高。因此用定氮法測得的蛋白質，稱之為粗蛋白。

每100g魚肉中所含的蛋白質＝全氮（％）×6.252024/7/23粗蛋白質之定量32各種食品由含氮量計算粗蛋白質含量之氮係數食品名稱氮係數小麥及其加工品5.70米5.95大麥、燕麥、黑麥5.83花生5.46大豆及其製品5.71栗、胡麻、胡桃5.30粟6.31南瓜、西瓜、向日葵等種子5.40乳及乳製品、人造奶油6.38動物膠(Gelatin)及其加工品6.55其他食品6.25不同的蛋其胺基酸構成比及方式不同，故各種不同的蛋白質其含氮量也不同。各種食品的蛋白質係可參見右表2024/7/23粗蛋白質之定量33各種試劑的作用—分解消化所用試劑溶液應用無氨蒸餾水配製在消化反應中，為了加速蛋白質的分解，縮短消化時間，常加入下列物質：濃H2SO4：

A：脫水使有機物炭化，然後有機物炭化生成碳，碳將H2SO4還原為SO2，本身則變為CO2

B：氧化

C：蛋白質與濃H2SO4生成NH3↑，CO2，SO2，H2O↑

D：NH3與H2SO4生成硫酸銨

2024/7/23粗蛋白質之定量34實驗注意事項--消化硫酸要根據樣品的用量來確定硫酸的用量如果取2～3g樣，則需25mL硫酸，如乾燥試樣超過5g，可按每克試樣5mL的比例增加硫酸用量。對於含鹽量高的樣品，如某些劣質魚粉、肉骨粉之類，須相應增加硫酸用量，因為NaCl+H2SO4→HCl↑，加熱後HCl會揮發。如硫酸缺少，過多的硫酸鉀會引起氨的損失，這時會形成硫酸氫鉀，而不與氨作用，因此當硫酸過多底物被消耗掉或樣品中脂肪含量過高時，要添加硫酸量。2024/7/23粗蛋白質之定量35各種試劑的作用—分解消化硫酸鉀可以提高溶液的沸點而加快有機物分解，它與硫酸作用生成硫酸鉀可提高反應溫度添加硫酸鉀的反應式如下：K2SO4+H2SO4→2KHSO42KHSO4→K2SO4+SO2+H2O但硫酸鉀加入量不能太大，否則消化體系溫度過高，又會引起已生成的銨鹽發生熱分解放出氨而造成損失(NH4)2SO4→NH3+(NH4)HSO32(NH4)HSO3→2NH3+2SO2+2H2O2024/7/23粗蛋白質之定量36各種試劑的作用—分解消化一般純硫酸的沸點在340℃左右，而添加硫酸鉀後，可使溫度提高至400℃以上，原因主要在於隨著消化過程中硫酸不斷地被分解，水分不斷逸出而使硫酸鉀濃度增大，故沸點升高，即添加鹽類可提高酸的沸點。因為消化溫度的提高與可溶鹽類的濃度成正比例，所以整個溶液的溫度隨著硫酸的蒸發而緩緩上昇，而導致溶解鹽類在小量酸液中濃縮。消化溫度若太高，會導致蛋白質量測定上的損失，其原因為當溫度超過此值時，氨分子轉變為氮而揮發逸失。2024/7/23粗蛋白質之定量37各種試劑的作用—分解消化如消化過程中，隨著硫酸的分解和水分的蒸發，硫酸鉀的濃度逐漸增大，則消化液沸點升高，加速了有機物的分解速度。但應注意硫酸鉀的用量不能過大，如果消化溫度太高，生成的硫酸銨也會分解出氨而使測定結果偏低。

(NH4)2SO4→NH3↑+(NH4)HSO4

(NH4)HSO4→NH3↑+S02↑+H2O在消化液冷卻後呈固態，則表明硫酸鉀用量過大，或硫酸用量不足。事實上，增加試樣量和硫酸量，其混合催化劑的量不必增加。硫酸鉀外，也可以加入硫酸鈉、氯化鉀等鹽類來提高沸點，但效果不如硫酸鉀。2024/7/23粗蛋白質之定量38各種試劑的作用—分解消化催化劑--硫酸銅硫酸銅的作用機理如下所示：

2CuSO4→CuSO4+SO2+O2C+2CuSO4→Cu2SO4+SO2+CO2Cu2SO4+2H2SO4→2CuSO4+2H2+SO2做蒸餾時鹼性指示劑此反應不斷進行，待有機物全部被消化完後，不再有硫酸亞銅(褐色)生成，溶液呈現清澈的藍綠色。故硫酸銅除起催化劑的作用外，還可指示消化終點的到逹，以及下步蒸餾時作為鹼性反應的指示劑

2024/7/23粗蛋白質之定量39各種試劑的作用—分解消化除硫酸銅外，常用的催化劑還有汞、氧化汞、硒粉、二氧化鈦和過氧化氫、還原鐵或上述物質的混合物。但考慮到效果、價格及為了防止環境污染等多種因素，應用最廣泛的是硫酸銅。對於一般穀物樣品，如玉米、小麥、稻穀等的消化，用硫酸銅作催化劑，只要適當增加鹽用量，使用強熱源，其效果與汞催化劑完全一樣；對於難消化物質的樣品，硫酸銅催化效果不如汞，測得蛋白質含量偏低。

添加氧化劑可幫助有機質消化，但氧化性較強的氧化劑會使氨氧化為氮氣損失。對於富含脂肪或消化過程中易發泡的樣品，可在消化前添加少量氧化劑，如過氧化氫，一般不用高錳酸鉀和次氯酸作氧化劑。

有的飼料檢測書上有快速測定蛋白質的方法，如硒粉催化法、硒粉過氧化氫催化法、過氧化氫催化法等，按照這些方法測定的蛋白質含量常常偏低0.3％～1.0％，如無特殊情況，特別是測定的結果作為飼料配方的資料時，不要用快速測定法。2024/7/23粗蛋白質之定量40影響氨化完全和速度快的因素:（1）K氏燒瓶和取樣量

K氏瓶的容量大小，頸部的粗細和長短等，也與熱源的強度有關。

如果稱1g以上的樣品，就需要K氏燒瓶最小500ml，800~1000ml的更好，這樣的K氏燒瓶對於縮短氨化時間，加熱的均勻性和完全氨化效果最好。（2）分解劑

A

H2SO4和K2SO4的添加量

有機物分解需要H2SO4H2SO4應根據有機物種類不同而加的量就不同如果試樣含脂類高，則加H2SO4多為了提高分解溫度，要大量添加K2SO4，但不能太多，也不能太少，太少則氨化不充分。K2SO4和H2SO4的添加比例是：

這種國內外公認比例1g樣品

K2SO4：

H2SO4=7g：12ml

還有一種比例：

K2SO4：H2SO4=10：20ml2024/7/23粗蛋白質之定量41影響氨化完全和速度快的因素:（2）分解劑

B

催化劑

用作催化劑的有Hg、HgO、Se，硒化合物，CuSO4、TiO2，其中Hg，HgO有毒但催化效果好TiO2，的結果偏低，採用不同的催化劑則消化時間不同

HgO消化麥子為38minSe與CuSO4消化麥子55minTiO2消化麥子70min所以在給出測定結果時要注明催化劑的類型。(3)氧化劑如雙氧水、次氯酸鉀等加速有機物氧化速度。2024/7/23粗蛋白質之定量42影響氨化完全和速度快的因素:（3）熱源的強度

消化時熱源的強度和迅速消化和完全氨化關係很大，即便鹽類K2SO4加得多，如果熱源弱，也是沒有意義的，熱源過強導致H2SO4損失，使氨回收率低

2024/7/23粗蛋白質之定量43影響氨化完全和速度快的因素:（4）氨的蒸餾和吸收及滴定

蒸餾有兩種:

1

直接蒸餾（裝置簡便，準確性好）

2

水蒸汽蒸餾

蒸餾加NaOH是30-50%，加的量為H2SO4量的4倍硫酸量為12ml，則NaOH為12×4=48mL，而且一般高於這個理論值，即加到50~55mL，如果NaOH量加的不夠就變成H2S，H2S是強酸，使顏色變紅。2024/7/23粗蛋白質之定量44實驗注意事項—樣品及消化樣品應時均勻的，若是固體樣品應事先研細，液體樣要混合均勻。固體樣品隨機取一定量研磨細的樣品放入恒重的稱量瓶中，置於105℃的烘箱中乾燥4h用坩鍋鉗將稱量瓶取出放入乾燥器內，待降至室溫後稱重，隨後繼續乾燥樣品，每乾燥1h，稱重一次，恒重即可。血清樣品取人血（或豬血）放入離心管中，於冰箱中放置過夜。次日離心除去血凝塊，上層透明清液，即為血清。吸出1ml血清加到50ml容量瓶中，用蒸餾水稀釋至刻度，混勻備用。試樣的用量可根據情況而定，標準法中規定為0．5～1g，這個用量對於濃縮料、魚粉、豆粕等高蛋白的樣品尚可，對於諸如稻穀、玉米等低蛋白的樣品則相對較少，可適當增加到2～3g，否則，滴定時鹽(硫)酸的消耗量只有1～2mL，會增加讀數和測定的誤差。2024/7/23粗蛋白質之定量45實驗注意事項—樣品及消化飼料樣品測定要求粉碎並全部過40目篩，目的在於使其具備均質性，便於溶樣，更易於消化。但也須掌握以下四點：（1）由於粉碎或過篩過程中，樣品容易產生自動分級，如玉米，其硬質部分常聚集在上面，軟質部分聚在下面。所以粉碎過篩後要重新混合均勻，以減少測量誤差；（2）粉碎完後，粉碎機中總會遺留少部分，這部分不能隨便丟棄，否則將影響樣品的均質性；（3）粉碎過程要快，以避免樣品的成分變化；（4）對於全價料(即使是顆粒全價料)和濃縮料，無須再粉碎，當然這是基於混合機的良好混合均度的；如果拿去粉碎，會丟失部分粉末物質，且粉碎後產生分級，反而降低了樣品的均質性。樣品放入K氏燒瓶時，不要黏附瓶頸上，萬一黏附可用硫酸緩慢沖下，以免被檢樣消化不完全，使結果偏低。2024/7/23粗蛋白質之定量46實驗注意事項--消化消化時不要用強火，應保持緩和沸騰，以免黏附在凱氏瓶內壁上的含氮化合物在無硫酸存在的情況下未消化完全而造成氮損失。先用小火加熱煮沸，不久看到消化管內物質碳化變黑，並產生大量泡沫，此時要特別注意，不能讓黑色物質上升到消化管的頸部，否則將嚴重地影響樣品測定結果。當混合物停止冒泡，蒸汽與二氧化碳也均勻地放出時，適當加強火力在消化時，應使全部樣品都浸泡在消化液中消化過程中應注意不時轉動凱氏燒瓶，以便利冷凝酸液將附在瓶壁上的固體殘渣洗下，促進其消化完全。如在瓶頸上出現有黑色顆粒，應小心地將消化管傾斜振搖，用消化液將它沖洗來，以免附在壁上的蛋白質在無硫酸存在的情況下，使氮有損失。。樣品中若含脂肪或糖較多時，消化過程中易產生大量泡沫，為防止泡沫溢出瓶外，在開始消化時應用小火加熱，並時時搖動，或者加入少量辛醇或液體石蠟或矽油消泡劑，並同時注意控制熱源強度。2024/7/23粗蛋白質之定量47實驗注意事項--消化消化時，如不容易呈透明溶液，可將K氏燒瓶放冷後，加入30%過氧化氫催化劑2~3ml，促使氧化。加氧化劑如雙氧水、次氯酸鉀等加速有機物氧化速度。消化液呈綠色透明後，繼續消化30min即可，但對於含有難以氨化的氮化合物的樣品，如含Lys、His、Trp或脯胺酸等時，需適當延長消化時間。有機物如分解完全，消化液呈藍或淺綠色，但含鉄量較多時，呈較深綠色。2024/7/23粗蛋白質之定量48實驗注意事項—蒸餾蒸餾裝置中連接的管路愈短愈好，可以避免蒸汽在管內，因管路太長而凝結成水滴，阻礙蒸汽流動。安全管一定要在水面之下離蒸汽產瓶底部約1~1.5cm，其功能在調節蒸氣產生瓶的壓力，避免因壓力過大而倒致蒸氣產生瓶破烈，所以安全管要粗且長（直徑約1cm、長1~1.5m）。控制蒸汽量或火力大小，蒸汽量太大也會將反應液噴進冷凝管中；火力太小，蒸餾速度慢，且易發生倒流；蒸汽產生要均勻，防止暴沸；一定要裝上蒸汽發生器的安全管，同時蒸氣產生瓶內加上幾粒玻璃珠、碎玻璃或沸石(10粒足夠)以防突沸。蒸餾時，蒸餾裝置不能漏氣，蒸汽發生要均勻充足，蒸餾過程中不得停火斷氣，否則吸收液將逆流至蒸餾瓶。2024/7/23粗蛋白質之定量49實驗注意事項—蒸餾蒸餾前，加鹼漏斗應採用水封措施，以免氨由此逸出損失。蒸餾前若加鹼量不足，消化液呈藍色不生成氫氧化銅沉澱，此時需再增加氫氧化鈉用量。向蒸餾瓶中加入濃鹼時，往往出現褐色沉澱。這時由於分解促進劑與加入的硫酸銅反應，生成氫氧化銅，經加熱後又分解生成氧化銅的沉澱，有時Cu離子與氨作用生成藍色的錯合物。氫氧化銅在70～90℃時發黑。蒸餾時要注意反應室裏的溶液總體積要控制，也就是說，在沖洗加樣口時用水要少，否則反應室溶液體積太大，液面升高，容易噴進冷凝管內。2024/7/23粗蛋白質之定量50實驗注意事項—蒸餾蒸餾完畢，應先將冷凝管下端提高液面清洗管口，再蒸餾1min後，以冷凝液洗冷凝管之內部與吸收液接觸部分，同理冷凝管外部以少量的蒸餾水洗滌，再關掉熱源，以避免吸收液逆流至蒸餾管中。氨是否完全蒸餾出來，pH試紙檢查餾出液是否為鹼性。硫酸或硼酸吸收液溫度不應超過40℃，否則對氨的吸收作用減弱而造成損失，此時可置於冷水浴中。混合指示劑在鹼性溶液中呈綠色，在中性溶液中呈灰色，在酸性溶液中呈紅色。2024/7/23粗蛋白質之定量51實驗注意事項—吸收

奈氏Nessler試劑檢查氨是否全部蒸完奈氏試劑—K2(HgI4)配製方法13.5gKI+1.3gHgCl2

溶於70毫升水。加30毫升4mol/L氫氧化鈉（或氫氧化鉀）溶液，必要時過濾，並存於玻璃瓶中蓋緊口。配製方法2溶解11.5gHgI2+KI10g於適量少許水，後加水稀釋至50ml,靜置後，取其澄清液，棄去沉澱，儲存於棕色瓶中。檢驗NH4+離子，遇銨根，離子析出黃色或紅棕色沉澱。2024/7/23粗蛋白質之定量52乙級粗蛋白質實驗操作

分解4位數分析天平稱至最後一位(記錄)以稱藥紙包裏投入分解瓶加硫酸時要戴手套分解時，先小火再大火，以防樣品噴至頸部導至分解時間延長空白以水量代替麵粉量，必須加一張稱藥紙，其餘步驟相同2024/7/23粗蛋白質之定量53蒸餾空白試驗：取空白分解液25mL進行蒸餾(乙級檢定無此操作)蒸餾操作依魚肉之蒸餾裝置操作方式實施之2024/7/23粗蛋白質之定量54蒸餾--蒸餾裝置洗滌：打開夾子1，關閉夾子2,3,4蒸餾瓶內加入30mL蒸餾水以本生灯或加熱包加熱蒸汽發生瓶(內裝八分滿的酸化水)，使其產生水蒸汽蒸汽發生瓶內須放有沸石(Boilingstone)或毛細管以防止突沸。冷凝管通入冷凝水，冷凝管下端放一50ml之量筒作為受器。調整加熱火源，使冷凝管餾出液達每分鐘約8ml左右。冷凝管下端放置內裝100ml蒸餾水之受瓶繼續以蒸汽清洗整個蒸餾裝置，直至蒸餾瓶內之水溶液達三分之一滿時先移開火源，關夾子1此時，蒸餾瓶之洗液和受瓶內之蒸餾水會分別進入廢液瓶中，亦會開夾子2使排出廢液，此即完成一次洗滌操作。重覆1~5之操作，再行洗滌1~2次2024/7/23粗蛋白質之定量55移開火源，關夾子1,2，開4(若有)打開夾子3，以25ml之球型吸管吸取25ml供試液由F(漏斗)處注入蒸餾瓶內並以少量蒸餾水沖洗漏斗，關閉夾子3，以25ml之球型吸管吸取25ml之0.05NH2SO4溶液注入250ml三角瓶內加入混合指示劑2~3滴，呈紫紅色該三角瓶置於冷凝管出口作為受瓶，冷凝管之出口必須浸入三角瓶內之硫酸溶液中。打開夾子3，以量筒加入25ml之30%NaOH然後關閉夾子3(可先加入2~3滴酚酞指示劑，以觀察溶液是否呈鹼性，此步驟可省略，從硫酸銅的顏色變化可知)。打開夾子1，並將火源放回蒸汽產生瓶下開始加熱使蒸汽進入蒸餾瓶。蒸餾至受瓶內至約100ml之餾出液(時間約15分鐘左右)。供試液之蒸餾-12024/7/23粗蛋白質之定量56供試液之蒸餾-2蒸餾操作完了前，將冷凝管尖端提出受瓶液面，續蒸餾約1分鐘，用水淋洗冷凝管尖端後停止蒸餾，洗液一併沖入受瓶，此時仍在進行蒸餾中，此舉可使冷凝管管內外液體洗至受瓶中。置入含100mL的蒸餾水的燒杯於冷凝管下端移開受瓶關本生灯關夾子1此時，蒸餾瓶之洗液和燒杯瓶內之蒸餾水會分別進入廢液管中，亦會開夾子2使排出廢液，此即完成一次蒸餾操作。然後打開活栓使廢液溜出(高溫之廢鹼溶液，待冷後倒廢鹼回收桶)如欲繼續蒸餾第二種試液，則蒸餾裝置必須重新以蒸汽洗過，才能進行蒸餾操作。※注意冷凝管出口需浸於0.05NH2SO4中蒸汽不可太強.而來不及冷凝2024/7/23粗蛋白質之定量57實驗操作

滴定2024/7/23粗蛋白質之定量58結果與計算a：試料供試液之滴定值(mL)b：對照試驗之滴定值(mL)F：0.1NNaOH之力價0.7003：1ml之H2SO4溶液相當於0.7003mg的氮。W：試樣取量(g)I=4：蒸餾的試樣液量(25mL)換算為分解試樣總量(100mL)的倍數N：氮係數(麵粉=5.70)2024/7/23粗蛋白質之定量59乙級範例空白滴定值：17.3mL樣品滴定值：6.7mL%59.17

25/10001100100mL5.71.046.7)mL-(17.3L0.7003mg/m(%)=´´xxxxx=mLgx

mggx

粗蛋白質2024/7/23粗蛋白質之定量60(4)下列何者測定過程中，通常不需使用乾燥器①水分②灰分③粗脂肪④粗蛋白。(4)在克氏定氮法分解樣品時所使用的酸是①鹽酸②硝酸③醋酸④硫酸。(2)當樣品含氮量多少時，即可使用克氏定氮法加以定量①1毫克以下②1～5毫克③5～10毫克④10毫克以上。(4)蛋白質的定量是利用試料中的①碳量②氫量③氧量④氮量來計算。(2)做粗蛋白定量時，各類食品其氮係數大約在①3～5②5～7③7～9④不一定。(1)蛋白質1克可供給①4大卡②5大卡③7大卡④9大卡的熱量。(1)以營養學的觀點，下列那一種食物的蛋白質品質最好①肉②麵包③米飯④玉蜀黍。(4)下列那一種食物，蛋白質含量較高①蔗糖②白米飯③麵包④牛奶。(4)肉類中不含下列那一種營養素①蛋白質②脂質③維生素B④維生素C。(3)人體之必需胺基酸有①6②7③8④9種。(3)測定蛋白質濃度的方法中，下列何者不需要標準品①福林-酚法＿②紫外吸收法③凱氏定氮法④雙縮脲法。＿問題2024/7/23粗蛋白質之定量61問題(B)黃豆若與穀類一齊食用，可補充穀類所缺乏的何種胺基酸，並提高其生理價值？（A）麩胺酸（B）離胺酸（C）色胺酸（D）酪胺酸。(2)豆腐是利用大豆中的①脂肪②蛋白質③醣類④維生素凝固而成。(3)蛋白質經鹽酸水解成為①甘油②葡萄糖③胺基酸④脂肪酸。(1)卵蛋白是屬於①單純蛋白質②複合蛋白質③衍生蛋白質④變性蛋白質。(2)蛋白質測定時，以濃硫酸為分解劑，其主要理由為①價格便宜②沸點較高③安全性較佳④分解後分解液容易保存。(2)測定食品中粗蛋白質時，分解樣品應使用①鹽酸②硫酸③硝酸④磷酸。(1)雞肉是屬於何種蛋白質①完全蛋白質②部份完全蛋白質③半完全蛋白質④不完全蛋白質。(1)以凱氏(Kjeldahl)法定量粗蛋白時，其中氨之蒸餾屬於①水蒸汽②減壓③分餾④加壓蒸餾。(1)尼海德林(Ninhydrin)試劑與α-胺基酸反應後其溶液呈①紫紅色②橙黃色③黑色④深綠色。2024/7/23粗蛋白質之定量62問題(O)素食者的蛋白質主要來源是豆類。(X)穀類的主要成分為蛋白質，在食品中可作為能源。(O)做粗蛋白定量時，不同種類的食品其氮係數也不相同。(○)粗蛋白質蒸餾滴定時所使用之指示劑是以甲基紅及甲基藍的酒精溶液混合而成。(○)以凱氏(Kjeldahl)法定量粗蛋白時，其中氨之定量是利用酸鹼中和滴定原理。(○)肉品中重要的營養成分之一，就是高品質又多量的蛋白質。(╳)穀物皆含有麥穀蛋白可形成麵筋。(O)肉類中所含的蛋白質量較麵粉、米為多。(X)蛋中所含的蛋白質營養價值很差。

(X)同重量的蛋白質比同重量的醣類熱量高。

(O)麵粉能提供人體植物性蛋白質。2024/7/23粗蛋白質之定量63問題蛋白質測定中硫酸銅及硫酸鉀在測定中起了什麼作用？消化時硫酸與硫酸鉀生成硫酸氫鉀，提升溫度至400度硫酸銅起到催化作用，加速氧化分解。硫酸銅也是蒸餾時樣品液鹼化的指示劑，若所加鹼量不足，分解液呈藍色不生成氫氧化銅沈澱，需加鹼量。凱氏定氮法進行蛋白質分析時主要由三個步驟組成，按照操作順序列出實驗步驟，並敘述每一步所發生的實驗現象，闡明為什麼NaOH或HCl(以硼酸為吸收液時)毫升數能用來間接測定樣品的蛋白質含量？2024/7/23粗蛋白質之定量64問題簡述食品中蛋白質測定的目的和意義。說明凱氏定氮法的定氮原理。消化時加入硫酸鉀和硫酸銅的作用是什麼？在蒸餾前加入氫氧化鈉溶液的作用是什？2024/7/23粗蛋白質之定量65問題

已知樣品的含氮量後，如何計算出蛋白質含量？為什麼要乘上蛋白質換算係數？不同種類食品的換算係數為何不盡相同？對於氮含量換算成蛋白質含量的等數，歷來採用6.25，這個數值是以蛋白質平均含氮而導出的數值，但是食品中含氮的比例，因食品種類不同，差別是很大的，我們在測定蛋白質時，應該是不同的食品採用不同的換算等數，一般手冊上列出了一部分換稱等數，用時可查，蛋=6.25，肉=6.25，牛乳=6.38，稻米=5.95，大麥=5.83，玉米=6.25，小麥=5.83，麩皮=6.31，麵粉=5.70，如果手冊上查不到的樣品則可用6.25，一般在寫報告時要注明採用的換算等數以何物代替。對於用各種原料混合製成的食品，採用占總氮量多的原料為換算等數，對於一些組成成分不明確的食品可採用6.25，我們在作報告時，一定要注明所用的換算等數。近幾年，國際組織認為6.25的換算等數太高，特別是對蛋品、肉品及魚類，貝類等動物性食品，根據以胺基酸組成總量計算的比6.25要低的多，目前還在爭論之中，以後很有可能比6.25要小一些。2024/7/23粗蛋白質之定量66問題在求麵粉中粗蛋白含量時,以秤量瓶秤取麵粉,總重量為25.9230g，瓶重為25.2125g,加入濃硫酸20ml,加熱分解5小時,等冷卻後稀釋至250ml，取10ml蒸餾,餾液以0.1NNaOH滴定,空白滴定值為10.25ml，樣品滴定值為5.32ml。0.1NNaOHfactor為0.9444,麵粉蛋白質係數為5.70,請算出麵粉中的蛋白質含量(%)為什麼在凱氏定氮法的計算中，從氮到蛋白質的換算系數會隨著不同的食品而變化？採用凱氏定氮法測一樣品的粗蛋白含量，根據下列記錄的數據計算：水分含量=8.0%，1號樣品質量=1.015克，2號樣品質量=1.025克，用於滴定的標準HCl濃度=0.1142mol/L，1號樣品所用的HCl溶液的體積=22.0mL，2號樣品所用的HCl溶液的體積=22.5mL，空白樣品所用的HCl溶液的體積=0.2mL，分別以樣品的乾基和濕基和計算粗蛋白質含量(假定該蛋白質含有17.5%的氮)2024/7/23粗蛋白質之定量67問題有A,B兩種蛋白質,其胺基酸組成如下:

請比較下列性質,A與B何者較大?(一)水合能力(保水性)(二)可能產生之褐變程度(三)280nm之吸光值(四)被UV照射後變性程度(五)受PH變化的影響(六)在低溫中變性的程度胺基酸A(mg/g蛋白質tein)B(mg/g蛋白質tein)Tryptophan20050Tyrosine22030Phenylalanine7040Leucine90350Lysine28050Arginine3030Glutamicacid103509009002024/7/23粗蛋白質之定量68問題食品蛋白質可藉由化學修飾(ChemicalModification)方法改善其功能性質，請舉例說明有哪些方法用於蛋白質化學修飾?蛋白質變性因素、對食品品質之影響請列出蛋白質分子內及分子間可能存在的各種鍵結或交互作用形式，並分別簡述其穩定性及不穩定化(即破壞)之環境條件以及在各種食品加工處理條件下可能發生之變化與影響。

2024/7/23粗蛋白質之定量69問題解釋下列可用來進行蛋白質研究或質量控制的定量方法的化學原理凱氏定氮法比濁法茚三酮法280nm紫外吸收法220nm紫外吸收法雙脲反應法(Biuret法)福林酚法Bradford法BCA法杜馬斯法紅外線光譜法寧海得林反應(Ninhydrinreaction)2024/7/23粗蛋白質之定量70問題

蛋白質的直接定量（紫外分光光度法，UV法）這種方法是在280nm波長，直接測試蛋白。選擇Warburg公式，光度計可以直接顯示出樣品的濃度，或者是選擇相應的換算方法，將吸光值轉換為樣品濃度。蛋白質測定過程非常簡單，先測試空白液，然後直接測試蛋白質。由於緩衝液中存在一些雜質，一般要消除320nm的“背景”資訊，設定此功能”。與測試核酸類似，要求A280的吸光值至少大於0.1A，最佳的線性範圍在1.0-1.5之間。實驗中選擇Warburg公式顯示樣品濃度時，發現讀數“漂移”。這是一個正常的現象。事實上，只要觀察A280的吸光值的變化範圍不超過1%，表明結果非常穩定。漂移的原因是因為Warburg公式吸光值換算成濃度，乘以一定的係數，只要吸光值有少許改變，濃度就會被放大，從而顯得結果很不穩定。蛋白質直接定量方法，適合測試較純淨、成分相對單一的蛋白質。紫外直接定量法相對於比色法來說，速度快，操作簡單；但是容易受到平行物質的干擾，如DNA的干擾；另外敏感度低，要求蛋白的濃度較高。2024/7/23粗蛋白質之定量71問題紫外分光光度法蛋白質及其降解產物的芳香環基，在紫外區內對某一波長具有一定的光選擇吸收，在280nm下，光吸收與蛋白質濃度（3~8mg/ml）成直線關係，因此，通過測定蛋白質溶液的吸光度，並參照事先用K氏定氮法分析的標準樣品，從標準曲線查出蛋白質的含量。2024/7/23粗蛋白質之定量72問題

比色法蛋白質定量

蛋白質通常是多種蛋白質的化合物，比色法測定的基礎是蛋白質構成成分：氨基酸（如酪氨酸，絲氨酸）與外加的顯色基團或者染料反應，產生有色物質。有色物質的濃度與蛋白質反應的氨基酸數目直接相關，從而反應蛋白質濃度。

比色方法一般有雙縮脲法-皮尼克法，BCA，Bradford，Lowry等幾種方法。2024/7/23粗蛋白質之定量73問題

雙縮脲法-皮尼克法雙縮脲在鹼性條件中，能與CuSO4結合成紅紫色的錯合物。蛋白質分子中含有肽鏈與雙縮尿素結構相似，也呈此反應。本法直接用於測定像小麥粉等固體試樣的蛋白質含量。但作為銅的穩定劑，酒石酸鉀鈉比甘油好些。小麥粉中的蛋白質能直接地一邊抽出一邊進行定量。2024/7/23粗蛋白質之定量74問題--福林酚法Folin-phenol法的優點是操作簡單，迅速，不需特殊儀器設備，靈敏度高，較紫外吸收法靈敏10-20倍，較雙縮脲法(Biuretmethod)靈敏100倍，反應約在15min內有最大顯色，並至少可穩定幾小時。其不足之處是此反應受多種因素千擾。在測試時應排除千擾因素或做空白試驗消除。Folin-phenol試劑可由A試劑與B試劑組成。A試劑由碳酸鈉、氫氧化鈉、硫酸銅及酒石酸鉀鈉組成。蛋白質中的肢鍵在鹼性條件下，與酒石酸鉀鈉銅鹽溶液起作用，生成紫紅色絡合物。B試劑是由磷鋁酸和磷鎢酸、硫酸、溴等組成。此試劑在鹼性條件下，易被蛋白質中酪胺酸的酚基還原呈藍色反應，其色澤深淺與蛋白質含量成正比。此法也適用於測定酪胺酸與色胺酸含量。Lowry法：以最早期的Biuret反應為基礎，並有所改進。蛋白質與Cu2+反應，產生藍色的反應物。但是與Biuret相比，Lowry法敏感性更高。缺點是需要順序加入幾種不同的反應試劑；反應需要的時間較長；容易受到非蛋白物質的影響；含EDTA，Tritonx-100，ammoniasulfate等物質的蛋白不適合此種方法。本法可測定範圍是25-250μg蛋白質。2024/7/23粗蛋白質之定量75問題

BCA（Bicinchoninine

acid

assay）法：這是一種較新的、更敏感的蛋白測試法。要分析的蛋白在鹼性溶液裏與Cu2+反應產生Cu+，後者與BCA形成螯合物，形成紫色化合物，吸收峰在562nm波長。此化合物與蛋白濃度的線性關係極強，反應後形成的化合物非常穩定。相對於Lowry法，操作簡單，敏感度高。但是與Lowry法相似的是容易受到蛋白質間以及去污劑的干擾。2024/7/23粗蛋白質之定量76問題

水揚酸比色法：樣品中的蛋白質經H2SO4消化轉化為銨鹽溶液後，在一定的酸度和溫度下與水揚酸鈉和次氯酸鈉作用生成有顏色的化合物，可以在波長660nm處比色測定，求出樣品含氮量，計算蛋白質含量。2024/7/23粗蛋白質之定量77問題

Bradford法：這種方法的原理是蛋白質與考馬斯亮蘭結合反應，產生的有色化合物吸收峰595nm。其最大的特點是敏感度好，是Lowry和BCA兩種測試方法的2倍；操作更簡單，速度更快；只需要一種反應試劑；化合物可以穩定１小時，方便結果；而且與一系列干擾Lowry，BCA反應的還原劑（如DTT，巰基乙醇）相容。但是對於去污劑依然是敏感的。最主要的缺點是不同的標準品會導致同一樣品的結果差異較大，無可比性。2024/7/23粗蛋白質之定量78問題二、請定義下列名詞並簡述其代表之意義(每小題5分，共20分)(一)碘價(Iodinevalue)(二)酸價(Acidvalue)(三)氮係數(Nitrogenfactor)(四)享特色差值(Huntervalues)L、a和b酸價(AV)定義中和1克油脂所需的KOB的毫升數來表示意義判斷油脂中游離脂肪酸的含量,可作酸敗程度判定碘價(IV)定義100克油脂以氣化碘滴定後以碘分子的克數來表示意義判斷油脂中不飽和脂肪酸的種類,可作為乾性油判定氮係數定義食品中蛋白質平均含有16%的氣,測定氮量乘以16/100=6.25的係數,則可算出粗蛋白質量,此係數稱為氮係數。意義食品中蛋白質與其他營養成分比較時,主要特徵即是其構成元素的氮含量大約一定,所以測定氮量,即可由氮量算出蛋白質量。享特色差值(Huntervalue)定義判斷食品中整體色澤表現,以L值表示黑色(0)或白色(100)'a值表示紅色(+100)或綠色(-80)而b值表示黃色(+70)或藍色(-80)等顏色變化意義除了作為判斷食品品質好壞之外,亦可以作為食品熟成(aging)或腐敗(putrefaction)的參考指標。2024/7/23粗蛋白質之定量79問題：蛋白質測定的意義何在？蛋白質是生命的物質基礎，是構成生物體細胞組織的重要成分，是生物體發育及修補組織的原料，一切有生命的活體都含有不同類型的蛋白質。人體內的酸堿平衡、水平衡的維持，遺傳信息的傳遞，物質的代謝及轉運都與蛋白質有關。人及動物只能從食品得到蛋白質及其分解產物，來構成自身的蛋白質，故蛋白質是人體重要營養物質，也是食品中重要的營養指標。在各種不同的食品中蛋白質含量各不相同。一般說來，動物性食品的蛋白質含量高於植物性食品，例如牛肉中蛋白質含量為20.0％左右，豬肉中為9.5％，大豆40％，稻米為8.5％。測定食品中蛋白質的含量，對於評價食品的營養價值、合理開發利用食品資源、提高產品品質、憂化食品配方、指導經濟審核及生產程序控制均具有重要的意義。2024/7/23粗蛋白質之定量80問題寫出圖上英文字母所代表器材名稱寫出氨氣行進方向(以英文字母代表行進順序)332024/7/23粗蛋白質之定量81問題請問凱氏定氮法中的常量，微量，和半微量有什麼區別？

氨的蒸餾有兩種方法：常量蒸餾法和半微量蒸餾法。常量法將樣品分解消化後全部用於測定，取樣量大，測定結果的準確性和精確度都很高。半微量法測定結果精密度稍差一點。一般情況下建議使用半微量法，因為如果蒸餾失敗的話，半微量法還可繼續蒸餾，而常量法只好全部重來，費時費力。當選擇蛋白質測定方法時，那些因素是必須考慮的？為什麼凱氏定氮法測定出的食品中蛋白質含量為粗蛋白含量？在消化過程中加入硫酸銅試劑有那些作用？樣品消化過程中加入的硫酸銅試劑有那些作用？樣品經消化蒸餾之前為什麼要加入氫氧化鈉？這時溶液的顏色會發生什麼變化？為什麼？如果沒有變化，說明了什麼問題？蛋白質蒸餾裝置的水蒸氣發生器中的水為何要用硫酸調成酸性？蛋白質的結果計算為什麼要乘上蛋白質換算係數？6.25的係數是怎麼得到的？2024/7/23粗蛋白質之定量82問題為什麼純的氫氧化鈉及鹽酸不能用為基本標準物質？答：鹽酸的水溶液具無限的安定性但水分會蒸發，酸量不會減少但需要補充水分，氫氧化鈉不但具潮解性而且會吸收二氧化碳，因此兩者都不能用為基本標準物質。在克耳逹法定量氮時，以硼酸代替鹽酸來吸收氨有什麼優點？答：生成的氨用鹽酸(硫酸)來吸收時，其蒸氣易與氨結合成氯化銨凝結管壁產生誤差。一食品試樣1.000g以克取達法處理，使生成的氨蒸餾到50.00mL，的0.100M的鹽酸中。未反應的酸以0.100M氫氧化鈉標準溶液反滴定，結果使用15.00mL。計算試樣含氮的百分率。(4.900%N)麵粉0.9092克以克耳達法處理，使生成的氨蒸餾到50.00mL0.05063MHCl。過量的酸需要0.04917MNaOH反逆滴定7.46mL。計算麵粉含蛋白質的百分率。(19.0%protein)若牛奶中蛋白質之含氮量為15.7%，那麼牛奶之氮係數為多少？6.37,5.83,6.25,5.71簡述染料結合法測定食品中的蛋白質的原理？說明甲醛滴定法測定氨基酸態氮的原理及操作要點。用什麼方法可對穀物中的蛋白質含量進行快速的品質分析？2024/7/23粗蛋白質之定量83補充資料

食物蛋白質2024/7/23粗蛋白質之定量84食物氮的存在形式

食物來源於動、植物，其中氮的存在形式有很大差別。肉類絕大部分的氮以蛋白質形式存在，僅有少量游離胺基酸或肽以及核酸、磷脂氮、肌酸、鵝肌肽；魚類則非蛋白氮含量豐富，約占總氮量的10～30%；乳氮約20%屬於非蛋白氮。植物性食物含氮化合物的成分差異更大，種子類幾乎95%的氮存在於蛋白質，而根莖類如馬鈴薯、胡蘿蔔等，蛋白質少於50%，多數氮以肽和游離胺基酸的形式存在，特別是馬鈴薯富含穀氨醯胺和門冬胺酸。此外，植物組織中含有不少非蛋白胺基酸，這些胺基酸有些能在體內代謝，而多數原樣不變從尿排出；還有少量是有毒的，如刀豆中的刀豆胺酸、蠶豆中的β氰基丙胺酸。新的蛋白質來源如單細胞蛋白含核蛋白很高，其量可達蛋白質總量的50%。由於核酸在人體內最終代謝產物為尿酸，大量食用可引起血漿尿酸濃度增高，易形成尿結石和痛風症。因此，單細胞蛋白不經去核酸處理，不宜作為人類食物的來源。2024/7/23粗蛋白質之定量85食物中蛋白質的含量食物中蛋白質的含量一般採用凱氏定氮法進行測定，然後換算成蛋白質的量。動、植物性食物蛋白的含氮量約為15.7～19%，平均16%。將測得的氮值乘以6.25（蛋白質換算係數），即得該食物的粗蛋白的含量。這種計算方法是按食物總氮全部以蛋白質的形式存在而計算的，對含非蛋白氮高的食物來說，蛋白質的計算的值無疑過高。因此用定氮法測得的蛋白質，稱之為粗蛋白。需要比較準確地計算時，可採用不同的換算係數（表）。2024/7/23粗蛋白質之定量86表氮換算成蛋白質的換算係數麵粉（中或低出粉率）5.70全麥5.83大米5.95花生5.46黃豆5.71芝麻5.30乳類6.382024/7/23粗蛋白質之定量87

常用食物的蛋白質含量食物成分表上食物的蛋白質含量是以每100g食物中的量表示的。這個量沒有表達該食物的蛋白質和熱能的關係。因為人體的熱量需要決定了食物的攝取量。因此，食物作為蛋白質來源的價值也決定於其本身的熱值。如成年男子從事輕體力勞動時，每日膳食熱能供給量為10920kJ，蛋白質供給量為80g。由食物蛋白提供的熱能約占總熱能的11%。適宜的食物，其中蛋白質提供的熱能占總熱能的10～15%。因此，將食物中蛋白質用蛋白質的熱能占食物總熱能的百分數表示（表），可以大體判斷該食物作為蛋白質來源的價值。從表看花生、黃豆、魚、瘦豬肉都是很好的食物蛋白的來源；如果選擇大米作為膳食唯一的食物來源。其蛋白質顯然不能滿足人體蛋白質的需要量。2024/7/23粗蛋白質之定量88表、幾種食物的蛋白含量及其熱能與食物總熱能的比（%）蛋白質g·100g-1食物*kJ·100kJ-1食物**蘋果0.32.8稻米（上白梗）6.77.8帶魚18.152.1小麥粉（富強粉）9.410.7土豆2.311.9花生米26.219.2瘦豬肉16.720.2雞蛋14.734.6黃豆36.335.豆腐（北）7.441.1牛肉20.146.**按食物成分表計算得出2024/7/23粗蛋白質之定量89膳食蛋白質的品質評價膳食的蛋白質的營養價值在很大程度上，取決於為機體合成含氮化合物所能提供必需胺基酸的量和模式。所有評定蛋白質品質的方法都是以此概念作為基礎的。評價的方法有許多種，但任何一種方法都以一種現象作為評定指標，因而具有一定的局限性，所表示的營養價值也是相對的，因此具體評價一種食物或混合食物蛋白時，應該根據不同的方法綜合考慮。以下敍述幾種常用的評價方法。（1）蛋白質消化率（digestibility,D）（2）蛋白質的生物價（biologicalvalue,BV）（3）蛋白質淨利用率（net蛋白質teinutilization,NPU）（4）蛋白質效力比（蛋白質teinefficiencyratio,PER）（5）相對蛋白質價值（realative蛋白質teinvalue,RPV）（6）胺基酸評分（aminoacidscore）或化學評分（chemicalscore）2024/7/23粗蛋白質之定量90（1）蛋白質消化率（digestibility,D）食物的蛋白質消化率是指食物蛋白受消化酶水解後吸收的程度，用吸收氮量和總氮量的比值表示：

D=吸收N/攝入N×100食物蛋白質真實消化率（turedigestibility,TD）可用進食實驗測得：

TD=[攝入N-（糞N-糞代謝N）]/攝入N×100糞氮不全是未消化的食物氮，其中有一部分來自脫落腸粘膜細胞、消化酶和腸道微生物。這部分氮稱為糞代謝氮，可在受試者攝食無蛋白膳時，測得糞氮而知，其量約為0.9～1.2g·24h-1。如果糞代謝氮忽略不計，即為表觀消化率(apparentdigestibility,AD):

AD=(攝入N-糞N)/攝入N×100表觀消化率比真實消化率低，對蛋白質營養價值的估計偏低，因此有較大的安全係數。此外，由於表觀消化率的測定方法較為簡便，故一般多採用。

2024/7/23粗蛋白質之定量91（1）蛋白質消化率（digestibility,D）用一般烹調方法加工的食物蛋白的消化率為：奶類97～98%、肉類92～94％、蛋類98%、大米82%、馬鈴薯74%。植物性食物蛋白由於有纖維包圍，比動物性食物蛋白的消化率要低，但纖維素經加工軟化破壞或除去後，植物蛋白的消化率可以提高。如大豆蛋白消化率為60%，加工成豆腐後，可提高到90%。2024/7/23粗蛋白質之定量92（2）蛋白質的生物價（biologicalvalue,BV）蛋白質的生物價：是為維持和/或生長而在體內保留氮和吸收氮的比值：BV=[攝入N-（糞N-糞代謝N）-（尿N-尿內源N）]/[攝入N-（糞N-糞代謝N）]×100蛋白質生物價值受很多因素的影響。對不同食物蛋白的生物價值進行比較時，實驗條件應該一致，否則即使同一種食物也會得出不一致的結果。如雞蛋蛋白的熱能占總熱能8%時，生物價值為91；占16%時為62。一般情況下，實驗動物多採用初斷乳的大鼠，飼料中蛋白質含量占10%。幾種食物蛋白的生物價值見表。2024/7/23粗蛋白質之定量93表、幾種食物蛋白的生物價生物價生物價生物價大米77馬鈴薯67全雞蛋94小麥67大豆64牛肉76麵粉52蠶豆58豬肉74甘薯72花生59蝦77玉米60白菜76牛奶852024/7/23粗蛋白質之定量94（3）蛋白質淨利用率（net蛋白質teinutilization,NPU）蛋白質生物價值沒有考慮在消化過程中未吸收而丟失的氮，所以Miller等建議將生物價值乘以消化率，稱之為蛋白質淨利用率：

NPU=BV×D=保留N/攝入N動物的蛋白質淨利用率也可用體氮法進行測定。用同窩斷乳大鼠分別飼以含維持水準蛋白質的實驗飼料（A組）和無蛋白的飼料（B組）各10d。記錄各組每日攝食量。實驗終了時測定各組動物屍體總氮量和飼料含氮量，按下列計算：

NPU=（BF-BK+IK）/IF式中:IF=A組N攝入量

BF=A組屍體總N量

BK=B組屍體總N量

IK=B組N攝入量也可測定實驗動物屍體的幹重和含水量，利用已知的幼鼠屍體N/H2O的平均比值計算屍體含氮量，則操作更為簡便。2024/7/23粗蛋白質之定量95（4）蛋白質效力比（蛋白質teinefficiencyratio,PER）蛋白質效力比是攝入單位重量蛋白質的體重增加數：

PER=體重增加（g）/攝入蛋白質（g）通常用雄性斷乳大鼠為實驗物件。Osborne等證明PER隨飼料中蛋白質的水準而改變，因而建議在適宜的蛋白質的水準上進行實驗。習慣上用含10%蛋白質的飼料，AOAC提出的標準步驟則用含9.09%蛋白質的飼料飼養動物。此測定最大的缺點是沒有把維持所需的蛋白質考慮在內，因而所得結果常不成比例。例如PER為2時，其品質不等於PER為1時的兩倍。不同實驗測得的PER的重複性往往不佳，為了減少實驗室間的變異，假設酪蛋白（參考蛋白）的PER值：校正的PER=PER×（2.5/酪蛋白的實測PER）2024/7/23粗蛋白質之定量96（5）相對蛋白質價值（realative蛋白質teinvalue,RPV）相對蛋白質價值是動物攝食受試蛋白的劑量-生長曲線斜率（A）和攝食參考蛋白的劑量-生長曲線斜率（B）比：

RPV=A/B×100以含3～4種不同劑量的受試食物蛋白餵養斷乳大鼠，將大鼠體重增長數（Y）對受試蛋白的進食克數（X）繪製回歸方程，求其斜率（A）。同時用含不同劑量的乳白蛋白（參考蛋白）餵養動物，同法得劑量-生長回歸方程及斜率（B）。假設前一回歸方