红托竹荪液体菌种生产技术规程

ICSFORMTEXT点击此处添加ICS号FORMTEXT点击此处添加中国标准文献分类号FORMTEXT     DBFORMTEXT52DBFORMTEXT/FORMTEXTTXXXXX—FORMTEXTXXXXFORMTEXT     FORMTEXT红托竹荪液体菌种生产技术规程FORMTEXTTechnicalinspectionofliquidspawnofPhallusrubrovolvatusFORMTEXT点击此处添加与国际标准一致性程度的标识FORMDROPDOWNFORMTEXT（本稿完成日期：2020.10.28）FORMTEXT    -FORMTEXTXX-FORMTEXTXX发布FORMTEXT    -FORMTEXTXX-FORMTEXTXX实施FORMTEXT     贵州省市场监督管理局   发布DBXX/XXXXX—XXXX前  言本文件参照GB/T1.1-2009《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则标准的结构和编写》的规定起草。给出的规则起草。本文件由贵州省农作物品种资源研究所提出。本文件由贵州省食用菌标准化技术委员会归口。本文件起草单位：贵州省农作物品种资源研究所、贵州省纳雍县农业农村局本文件主要起草人：桂阳、黄万兵、朱国胜、刘宏宇、卢颖颖、龚光禄、杨通静、张军、王沁、胡腾文DBXX/XXXXX—XXXX红托竹荪液体菌种生产技术规程范围本文件规定了红托竹荪（红托鬼笔）（Phallusrubrovolvatus(M.Zang,D.G.Ji&X.X.Liu)Kreisel）液体菌种生产术语和定义、生产技术要求、液体菌种生产工艺与流程、记录与存档、贮藏等。本文件适用于红托竹荪液体菌种的生产。规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB150.2压力容器—第二部分:材料GB5749生活饮用水卫生标准GB50073洁净厂房设计规范NY/T528食用菌菌种生产技术规程NY/T1742食用菌菌种通用技术要求术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1液体菌种liquidspawn 用于生产和销售的菌丝体及其生长基质组成的液体繁殖材料，包括摇瓶液体菌种、发酵罐菌种。3.2液体菌种发酵罐cultivationapparatusforliquidspawn指进行液体菌种培养的专用设备，符合GB150.2要求。3.3液体菌种接种器liquidinterfacetrapinoculator指能将液体菌种从培养器中按无菌操作要求转接到固体培养基物料上的设备。3.4固体专用种solidspecialspawn指在玻璃试管/平皿上固体培养基内生长的纯菌丝体培养物，专供接入液体培养基使用。生产技术要求液体菌种生产厂房4.1.1液体菌种生产场所要求生产场所符合NY/T528的环境要求。液体菌种生产场址应建在交通方便，水源和电源充足，无有害气体、烟雾、灰沙，远离垃圾场、畜禽场舍等有污染的地方，有硬质路面且排水良好的道路。4.1.2厂房要求厂房设计应符合NY/T528的要求，增设摇瓶菌种培养室、发酵罐菌种培养室。4.1.3液体菌种生产车间要求液体菌种生产厂房设计达到GB50073要求。液体菌种生产车间地面应能防水、防滑、防腐蚀、防渗漏、易清洗，有适当的排水坡度（1.0%～1.5%）和良好的排水系统，排水沟必须是圆弧式的明沟。墙壁和天花板应能防潮、防霉、防水、易清洗。门窗应设置防蚊蝇纱网。车间入口处应设置洗手、消毒和干手设施。车间安装排气管道、进水管道、蒸汽管道、热水循环管道或者排风设备，设封闭式废物桶。液体菌种接种间应设置缓冲间。灭菌间、冷却间、培养间符合NY/T528要求。生产设备与设施4.1.1主要生产设备包括液体菌种发酵罐、空气压缩机、高效空气过滤器、液体菌种接种器、高压蒸汽灭菌锅、蒸汽锅炉、净化工作台、恒温摇床、恒温培养箱、除湿机、自备电源（发电机）等。液体菌种发酵罐、高压灭菌锅和蒸汽锅炉应符合GB150.2要求；高效空气过滤器：对粒径0.1μm～0.2μm粒子的捕集效率在99.999%以上，且所有材质应耐126℃高温灭菌。4.1.2主要基本设施液体菌种生产车间应包含配料间、灭菌室、冷却间、接种间、培养间、发酵间、化验室、菌种室等，其规模要配套，布局合理，要有调温设施。化验室有相应的实验检测设备，菌种室有灭菌设施和常规用具。培养原料应符合NY/T528要求，生物制剂及天然材料水不溶物物料应过100目筛。4.4菌种选择选用高产、优质、抗逆性强、商品性好的红托竹荪品种，生产质量符合NY/T1742的要求。引种的品种须进行适应性出菇试验验证。液体菌种生产工艺流程红托竹荪液体菌种生产工艺流程见图1。放罐放罐发酵罐摇瓶固体专用种配料分装灭菌冷却配料分装灭菌冷却检验检测15-25天液体菌种液体菌种检查摇瓶菌种10-15天搅拌

搅拌

图1红托竹荪液体菌种生产工艺流程摇瓶液体菌种生产技术5.1液体培养基配方及制作5.1.1液体培养基配方见附录A。5.1.2分装摇瓶液体培养基分装量为不超过摇瓶容积的60%。5.1.3灭菌液体培养基配制分装后应立即灭菌。灭菌条件：0.120MPa～0.140MPa、温度达121℃时，高压蒸汽灭菌30min～40min。5.1.4冷却冷却间使用前要进行清洁和除尘处理。将灭菌后摇瓶液体培养基放置在冷却间中，冷却到液体培养基降温至室温（≤25℃）。5.2接种在净化工作台上严格按无菌操作规程，将合格的红托竹荪固体专用种接种，用接种针挑取3～5块（4mm×4mm～5培养5.3.1培养条件在使用培养室的前两天，采用药物或者紫外灯消毒。摇瓶液体菌种应置于摇床上震荡培养，震荡频率120r/min～125r/min，振幅6cm～10cm，恒温25℃，培养时间12d～5.3.2培养期检查摇瓶液体菌种培养期间应定期检查和记录，及时拣出不合格菌种，并应及时留样用于检验。发酵罐菌种生产技术空气过滤器的检查与灭菌6.1.1检查使用前应拆分检查空气过滤器滤芯，要求无油污、料污、无破损，外壳内外壁要求无污物、光亮洁净。6.1.2灭菌对检查后的空气过滤器高压蒸汽灭菌，灭菌条件：0.120MPa～0.140MPa、温度达121℃时，高压蒸汽灭菌30min～40min。发酵罐检查与清洗6.2.1检查检查罐上的全部阀门、安全阀、压力表，要求完好，工作正常。6.2.2清洗用流水冲洗罐体内、外和全部阀门，到达内壁无任何培养料残余物，无死角的洁净程度。6.2.3空消发酵罐初次使用、出现染菌、长期放置、更换品种时，都要求利用外源蒸汽空消进行灭菌。灭菌条件：发酵罐罐体压力0.120MPa～0.140MPa、温度达121℃时，高压蒸汽灭菌30min～40min。发酵罐菌种培养基要求与制作6.3.1原料要求发酵罐菌种培养基原料应符合NY/T528要求，同时水不溶物物料应过100目筛。用水符合GB5749要求。6.3.2培养基配方配方见附录Ａ。6.3.3投料与定容将配制好的液体培养基原料充分溶解，加适量温水搅拌均匀，倒入或用泵抽入发酵罐中，加水定容至所需体积（液体培养基占罐体总容积不超过80%）。装料时保持进气管压0.10MPa～0.15MPa，通气鼓动液体基料，使料混匀，至灭菌料温上升到90℃时，关闭进气管通气。清理加料口，不应用残留的物料，拧紧上料口盖。6.3.4发酵罐实消投料定容完成后，利用外源蒸汽实消灭菌。灭菌条件：发酵罐罐体压力0.120MPa～0.140MPa、培养基温度达到121℃时，高压蒸汽灭菌30min～40min（发酵罐容积100L～1000L），应防止灭菌死角。6.3.5冷却和调压实消灭菌结束后将冷水通入发酵罐夹层或者内置冷却系统中循环，使液体培养基降温至24℃～26℃。降温过程中当压力降到0.05MPa时，及时向发酵罐内通无菌空气防止罐压回零，并维持压力到0.02MPa～0.04MPa。接种利用火焰保护接种法。把火圈放在投料口的上方点燃，此时打开进料口盖，把摇瓶液体菌种迅速投入罐中（接种量的体积比为1%～3%），迅速盖好进料口盖、拧紧。移走火焰圈，液体菌种进入培养阶段。发酵罐菌种培养条件培养时控制进气阀的无菌空气通风量至1m³/h（发酵罐容积100L～1000L）、罐压保持在0.02MPa～0.04MPa之间、培养温度24℃～25℃内。培养12d～15d后，发酵罐菌种即可达到放罐指标。留样及检测留样红托竹荪固体专用种应留样备查，留样的数量应以每个批号3支~5支或皿，于4℃~6℃下贮存，贮存至经转接的栽培袋正常发菌。每个批号摇瓶菌种取1mL装于2mL的冻存管，留存12支。每个批号发酵罐灭菌后的空白培养基取样取1mL装于2mL的冻存管，留存12支；每个批号放罐前48h从发酵罐中取1mL装于2mL的离心管，留存12支；每个批号发酵终止后取样取1mL装于2mL的冻存管，留存12支6.6.2无菌检测摇瓶液体菌种样品、发酵罐灭菌后的空白培养基样品应在无菌检测琼脂平板上25℃恒温培养2d～5d，及时观察有无细菌、霉菌、酵母菌等杂菌生长。培养过程中定期从发酵罐中取出的样品应及时镜检与无菌检测，同时确定菌丝生长发育状态与排除杂菌污染。发酵罐菌种放罐指标6.6.1菌种感官指标发酵罐菌种感官指标符合表1的要求表1感官指标项目指标菌液色泽菌丝球呈白色，菌液呈淡黄色，澄清透明。菌液形态菌液稍粘稠，菌丝体稠密，菌丝球均匀悬浮于液体中，不分层。菌液气味浓烈的菌香味，无酸、臭味异味。发酵罐排气口气味正常，无明显改变。6.6.2菌种理化指标发酵罐菌种理化指标见表2表2理化指标项目指标pH值3.0-4.0菌丝湿重（g／100ml）＞7显微镜下菌丝形态和杂菌鉴别可见红托竹荪荪菌种液体培养中特有的菌丝形态，球状和丛状菌丝体大量分布，菌丝粗壮。无霉菌菌丝、酵母和细菌菌体。留存样品无菌检查平板有红托竹荪菌丝生长，无霉菌、酵母菌、细菌等杂菌生长。贮藏红托竹荪液体菌种生产后应立即使用。如不能立即使用，需要贮藏发酵罐内持续通无菌空气保持罐压0.02MPa～0.04MPa，常温下可保存1d运输不宜长途运输。记录和存档发酵罐菌种生产的每个环节都要有详实的生产记录，由具体操作人员现场记录填写，定期由主管领导审核，签字后归档保存，至少两年。

（资料性附录）

红托竹荪液体菌种培养基配方A．红托竹荪液体菌种培养基配方红托竹荪液体菌种培养基配方包括但不限于：葡萄糖5g、果糖25g、蛋白胨5g、、酵母粉1g、硫酸铵2