SN∕T 4849.5-2017 出口食品及饮料中常见小浆果成分的检测方法 实时荧光PCR法 第5部分：蔓越莓和蓝莓

出口食品及饮料中常见小浆果成分的检测方法实时荧光PCR法第5部分：蔓越莓和蓝莓I本部分为SN/T4849的第5部分。1检测方法实时荧光PCR法SN/T4849的本部分规定了出口食品及饮料中蔓越莓和蓝莓成分的检测方法实时荧光PCR法。莓为原辅料的食品及饮料中蔓越莓和蓝莓成分的定性检测(清汁及果酒除外)低检出限(LOD)为1%(体积比)。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T27403—2008实验室质量控制规范食品分子生物学检测浆果是指由一个子房或联合其他花器发育成的柔软多汁的肉质单果，由一rocarpon),小果红莓苔子(毛蒿豆)(Vaciniummicrocarpum),红莓苔子(北方蔓越橘)(Vaccinium2dNTP:脱氧核苷酸三磷酸(deoxyribonuleosidetriphosphate)。dTTP:脱氧胸苷三磷酸(deoxythymidUNG:尿嘧啶N-糖基化酶(uracilN-glTris:三羟甲基氨基甲烷[Tris(HydroEDTA:乙二胺四乙酸(EthylenediaminetetTaq:水生栖热菌(ThernusaquOD:光度密度(opticald用特异性引物进行实时荧光PCR扩增，通过实时荧光信号曲线判定是否存在蔓越莓或蓝莓成分。针详见表1。蔓越莓和蓝莓扩增靶标序列参见附录A。引物/探针序列(5'→3')扩增片段长度靶基因内参照F:GCTGAAGCAGCTACTTTCGAR:AGGAGCCGTGTGAGATGAP:FAM-TGGAGTGGGAGAGTCAGAGTCGAAAAGA蔓越莓和F:CATTTTAGCTTCAAATGGR:TGAGTCCGTACCATTGAP:FAM-ACGCTTGAAAGATAGCCCAGAAAGTCGA35.2三氯甲烷(氯仿)。5.3异丙醇。5.670%乙醇(体积分数)。5.8蛋白酶K(20mg/mL)。5.9实时荧光PCR反应混合液：12.5μL反应体系包括：1U～2U(Unit,酶学单位)的Taq酶、1×6仪器设备6.1实时荧光PCR仪。6.2核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计。6.3恒温水浴锅。6.4离心机：离心力≥12000g。6.6粉碎装置。6.7涡旋震荡器。6.8pH计。6.10烘箱。7检测步骤7.1样品前处理鲜果、冷冻果样品直接粉碎，6000r/min离心，取沉淀物部分。果干、果酱、蜜饯类样品先用蒸馏水浸泡清洗3次，再粉碎。果汁样品取适量15000r/min离心30min,取沉淀部分。7.2DNA提取取50mg~500mg样品，加入1mLCTAB提取缓冲液，同时加入0.01倍体积的20mg/mL蛋白酶K,65℃温育1h～2h,期间不时震荡混匀，应保证样品自由悬浮于液体中，必要时再加入适量CTAB提取缓冲液；取出后12000r/min离心10min,转移上清至2mL离心管中，加入0.7倍体积的三氯甲烷，剧烈震荡混匀，12000r/min转速下离心10min;转移上清至另一灭菌的离心管中，再加入0.7倍体积的三氯甲烷，剧烈震荡混匀，室温下12000r/min离心10min;转移上清至干净离心管中，加入等体积的CTAB沉淀液混匀，室温沉淀1h;13000r/min的转速离心10min;弃上清，加入350μL1.2mol/LNaCl溶液，充分溶解沉淀；加入0.8倍体积的异丙醇或2倍体积-20℃冰箱中预冷的无水乙醇混匀，-20℃放置30min,12000r/min4℃离心10min,弃上清，用70%乙醇洗涤沉淀一次，12000g4℃离心10min,弃上清，室温下晾干。加入50pL～100μL双蒸水，室温10min,混匀，4-20℃保存。使用核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计分别检测260nm和280nm处的吸光值Azbo和A₂s0。实时荧光PCR反应混合液DNA模板(5ng/μL～100ng/μL)灭菌ddH₂O5b)40<Ct值<45,则重复实验一次。再次扩增后，Ct值<45,应查看相应的扩增曲线并结合荧检测过程中防止交叉污染的措施按照GB/T27403—2008中附录D的规定执行。6CATTTTAGCTTCAAATGGTTCGTCTCTTTTGATGAATAAATGGTTTCTGGGAATGTTATTTTTCCATATGGGCTCAACCAAGAAGGATATCCAATAATTCCTTCGACTTTCTGGGCTATCTTTCAAGCGTACGATTAAAATTTGGCTTCAAACGGGTCGNNTCN