NYT 2695-2015 牛遗传缺陷基因检测技术规程

牛遗传缺陷基因检测技术规程I本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。1SN/T2497.15进出口危险化学品安全试验方法第15部分：2显子第73位碱基突变(G→T)引起的一种牛隐性遗传缺陷。其典型临床症状表现为胚胎或胎儿死亡，由尿苷酸合酶基因UMPS(uridinemonophophatesynthase)的C-末端405处的密码子存在一个点突变导致密码子CGA转变为终止子TGA引起的一种牛隐性遗传缺陷。其典型临床症状为胚胎或胎儿期死亡，死亡率达100%。由凝血因子XI基因FXI(factorXI)外显子12上插入了一个大小为76bp的DNA片段引起的一种牛骡蹄症mulefoot,MF由低密度脂蛋白受体结合蛋白基因LPR4(lowdensitylipoproteinreceptorrelatedprotein4)第33外显子发生了两个碱基的突变(C4863A,G4864T)引起一种牛遗传缺陷。其典型临床症状为在不同品种中杂合个体表现不同的外显率，缺陷个体一般一只或多只蹄子均可表现骡蹄牛蜘蛛腿综合征spiderlegofarachnomeliaandthrogryposis,SAA;arachnomeliasyndrome,AS在瑞士褐牛中由SOUX(sulfiteoxidase)基因第4外显子第363位插入一个碱基(c.363-364insG)而引起，在西门塔尔牛中由MOCS1(molybdenumcofactorsynthesisstep1)基因位于第11外显子第1224～1225位CA两个碱基的缺失而引起的一种牛隐性遗传缺陷。其典型临床症状为在瑞士褐牛和在调查某种遗传病畜禽各个个体的发病情况后，采用特定的符号和格式绘制345.2.171%～3%琼脂糖凝胶：称取1g～3g琼脂糖，加100mLTAE煮沸，等降至50℃~60℃时，加入5.2.182%～5%琼脂糖凝胶：称取2g～5g琼脂糖，加100mLTAE煮沸，等降至50℃~60℃时，加入剂处理，并4℃短期保存，-20℃及以下低温保存备用；组织、带毛囊的毛发浸入75%的酒精、精液，按GB/T27642—2011中附录B规定的方法执行。DNA样品操作注意事项按SN/T1119中规定引物配制按NY/T1670—2008中6.2.1条款的规定执行，引物信息参见附录A中A.1。按附录A中A.2的要求配制PCR反应体系，并按A.3的程序进行扩增。PCR操作中防止污染等取5μL～10μLPCR产物，上样于1%～3%琼脂糖凝胶中进行电泳，结果与标准确定是否为预期扩增片段。如果不是预期扩增片段，重复6.3和6.4步骤，直到6.5.1错配PCR突变分析利用牛基因组的特异性引物1-3作为内标引物扩增，重复6.4步骤检测PCR反应产物；利用致病基因的特异性扩增引物1-4筛查致病突变，重复6.4步骤检测扩增产物，若存在该条带说明被测个体6.5.2SSCP分析6.5.3RFLP分析按B.1和B.2的要求配制RFLP反应体系，在37℃水浴中温浴4h,然后酶切产物用2.0%～5.0%孟德尔定律对各个体的表现型和基因型进行分析，通过分析可以判断某种遗传51)引物1-1(参见附录A中表A.1)的PCR扩增产物长度为177bp,出现2条带(AA)的判2)引物1-2(参见附录A中表A.1)的PCR扩增产物长度为249bp,出现2条带(AA)的判c)错配PCR突变分析(PCR-MAMA)a)PCR-SSCP:引物2-1(参见附录A中表A.1)的PCR扩增产物长度为187bp,出现2条带1)引物2-2(参见附录A中表A.1)扩增产物为136bp条带，出现108bp和28bp2条带的2)引物2-3(参见附录A中表A.1)扩增产物为324bp条带，出现193bp和131bp2条带a)PCR-SSCP:引物3-1(参见附录A中表A.1)的PCR扩增产物长度为177bp,出现2条带2)引物3-3(参见附录A中表A.1)扩增产物为282bp条带，出现194bp和88bp2条带的6C中图C.11。b)引物6-2和引物6-3(参见附录A中表A.1)在同一体系扩增MOSC1基因产物为208bp条外显子上)碱基缺失为C或A,则判定为隐性基因携带个体；扩增产物经DNA测序，AS1224～1225位置上(第11外显子上)碱基缺失为CA,则判定为患病个体。检测结果判定DNA测序，LRP4基因第33外显子LPR44863～4864位置上为CG,判定为正常个体；扩增产物为表A.1遗传缺陷基因引物引物序列长度退火温度℃牛脊椎畸形SLC35A3基因F1-1:5'-TCAGTGGCCCTCAGATTR1-1:5'-CCAAGTTGAATGTTTCTTF1-2:5'-AGCTCTCCTCTGTAAR1-2:5'-TCTCAAAGTAAACF1-3:5'-TGGAAGCAAAGAACCCR1-3:5'-TCGTCAGAAACCGCAF1-4:5'-CACAA'TTTGTAGGTCTCR1-4:5'-TCCACACTGATGGTTTGG牛白细胞黏附缺陷症，BLADCD18基因F2-1:5-AGTTGCGTTCAACGTGACR2-1:5'-AACAGGTGCTTCCTGGGCTF2-2:5'-AGTTGCGTTCAACGTGACR2-2:5'-AACAGGTGCTTCCTGGGCTF2-3:5'-CCTGCATCATATCCAR2-3:5'-GTTTCAGGGGAAGA遗传缺陷基因引物引物序列℃F3-1:5'-GGCCAGGGACCGTGTTCATTGAGGR3-1:5'TTCCIGGGACCCCGTGAGACACAF3-2:5'-GGCCAGGGACCGTGTTCATTGAGGAR3-2:5'-TTCCTGGGACCCCGTGAGACACAF3-3:5′-TTTTCAAGACCACCCR3-3:5'-CATACTTGGCTCCUMPS基因4F4:5'-GAACATTCTGAATTIGTGATR4:5'-GCTTCTAACTGAACTC牛凝血因子XI缺乏症，FactorXIFXI基因5F5:5'-CCCACTGGCTAGGAAR5:5'-CAAGGCAATGTCAT牛蜘蛛腿综合征，SOUX基因(瑞士褐牛)F6-1:5'-CGCAGATATACCAGGGR6-1:5'-CGATAGGTGTCTGG(德系西门塔尔牛)F6-2:5'-CCTGACATGAACAGGR6-2:5'-CCAGGTGGGAACTGF6-3:5'-TGGAGAAACTCACTCTGTGR6-3:5'-GTGTTCAGGTTCTGAGALRP4基因7F7:5'-AGCGTGTGGACAAGTACR7:5'-ACCTCAAGCTCAAA9表A.2PCR反应体系单倍反应体系，Taq酶(5U/μL)模板DNA(50ng/μL～100ng/pL)总体积注：PCR反应体系可以根据实际情况而调整。PCR反应程序见表A.3。表A.3PCR反应程序最后延伸延伸51℃~66℃注：具体退火温度参照表A.1。酶切反应体系见表B.1。表B.1酶切反应体系10×缓冲液限制性酶内切酶总体积引物对应内切酶见表B.2。引物内切酶引物2-2引物2-3引物3-2引物3-3引物4(资料性附录)电泳结果及系谱分析模式图C.1CVM结果模式图C.1.1CVMPCR-SSCP结果(引物1~2)参见图C.1。C.1.2CVMPCR-MAMA结果模式图(引物1-3)参见图C.2。图C.2SLC35A3基因的PCR-MAMA结果模式图C.2BLAD结果判定图C.2.1BLADPCR-SSCP结果模式图(引物2-1)参见图C.3。图C.3CD18基因的SSCP模式图C.2.2BLADTaqI酶切后RFLP结果模式图(引物2-2)参见图C.4。 4,5——AB型；7——DL2000图C.4CD18基因的RFLP结果模式图C.2.3BLADTaqI酶切后RFLP结果模式图(引物2-3)参见图C.5。图C.5CD18基因的RFLP结果模式图C.3.1CNPCR-SSCP结果(引物3-1)参见图C.6。图C.6ASS基因的PCR-SSCP结果分析C.3.2CNAvaⅡ酶切结果模式图(引物3-2)参见图C.7。 C.3.3CNEco47I酶切结果模式图(引物3-3)参见图C.8。11图C.8ASS基因的RFLP结果模式图DUMPSAvaI酶切结果模式图参见图C.9。6三三三三 NY/T2695—2015C.5FXPCR检测结果模式图FXIPCR检测结果模式图参见图C.10。图C.10FXI基因PCR结C.6.1ASP