生物（人教版选修1）课件专题5课题2多聚酶链式反应扩增DNA片段

专题五DNA和蛋白质技术课题二多聚酶链式反应扩增DNA片段1．说明PCR的原理；2．说出PCR技术的基本操作；3．说出PCR技术的应用。一、PCR原理1．概念：PCR即________________，是一种______迅速______________的技术，它能以极少量的________为模板，在短时间内复制出上百万份的____________。多聚酶链式反应体外扩增DNA片段DNADNA拷贝2．细胞内DNA复制所需基本条件参与的组分在DNA复制中的作用解旋酶______________________DNA母链_______________________________________合成子链的原料DNA聚合酶______________________引物(RNA)为DNA聚合酶提供合成的3′端起点__________为解螺旋和合成子链供能打开DNA双链提供DNA复制模板4种脱氧核苷酸催化合成DNA子链ATP3.细胞内DNA复制特点(1)DNA的两条链是反向平行的，通常将DNA的羟基末端称为__________，而磷酸基团的末端称为__________。DNA聚合酶不能________开始合成DNA，而只能______________，因此，DNA复制需要________。(2)DNA的合成方向总是从子链的__________和__________延伸。3′端5′端从头从3′端延伸引物5′端3′端4．PCR原理(1)DNA的热变性：在______________的温度范围内，DNA__________结构解体，_______分开，这个过程称为_______。当温度缓慢_______后，两条彼此_______的DNA链又会重新结合成_______。(2)子链的合成：①需要______；②合成方向总是从子链的____________________。80～100°C双螺旋双链变性降低分离双链引物5′端向3′端延伸二、PCR的反应过程1．PCR一般要经历__________次循环，每次循环可以分为________、________和________三步。2．在循环之前，常要进行一次预变性，以便增加大分子模板DNA彻底变性的概率。3．变性：在90°C以上时，DNA解旋。复性：在50°C左右时，________与___________结合。延伸：在72°C左右时，合成新的__________。三十多变性复性延伸引物DNA单链DNA链4．从第二轮循环开始，上一次循环的产物也作为_______参与反应，并且由__________延伸而成的DNA单链会与__________结合，进行DNA的________，这样，DNA聚合酶只能__________复制处于__________之间的DNA序列，使这段固定长度的序列成指数扩增。模板引物Ⅰ引物Ⅱ延伸特异性地两个引物三、实验操作1．实验用具(1)PCR仪：自动调控__________，实验DNA扩增。(2)微量离心管：总容积为0.5mL，实际上是进行______________的场所。(3)微量移液器：用于定量转移PCR中的液体。温度PCR反应微量移液器轻轻弹击102．实验步骤准备：按照PCR反应体系中配方将所需要的试剂摆放在 实验桌上移液：用____________按照配方在微量离心管依次加入 各组分混合：盖严离心管口的盖子，用手指__________管壁， 使反应液混合均匀离心：将微量离心管放在离心机上，离心约_____s3．操作提示(1)为避免____________等因素的污染：所用仪器、缓冲液、蒸馏水等，在使用前必须进行__________。(2)缓冲液和酶分装成小份，________°C保存。(3)在微量离心管中添加反应成分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都__________。所有的成分都加入后，________离心管口的盖子外源DNA高压灭菌－20必须更换盖严2．PCR反应通常使用的微量离心管是一种薄壁塑料管，请问此实验中能否用玻璃管来代替塑料管？为什么？提示：不能，玻璃管对DNA具有吸附作用，如果用玻璃管，DNA会吸附到管壁上，使反应无法进行。一、PCR技术与体内DNA复制的比较1．PCR技术(1)PCR：多聚酶链式反应的简称，是一种体外迅速扩增DNA的技术，它能以极少量的DNA为模板，在几小时内复制出上百万份的DNA拷贝。(2)扩增方向：总是从子链的5′端向3′端延伸。2．PCR反应与体内DNA复制的比较细胞DNA内复制PCR反应解旋在解旋酶作用下，细胞提供能量，部分解开加热至90℃以上时，双链全部解开酶DNA解旋酶、DNA聚合酶耐高温的DNA聚合酶引物一小段RNADNA或RNA能量ATP不加循环次数生物自身控制30多次细胞DNA内复制PCR反应子链合成一条链连续合成，另一条链不连续合成两条子链为连续合成，温度为72°C产物完整DNADNA片段特点边解旋边复制、半保留复制体外迅速扩增相同点①都需要模板；②原料都是四种脱氧核苷酸；③都需要在一定的缓冲液中进行，都遵循半保留复制；④DNA的合成方向都是从子链的5′端向3′端延伸

解旋酶的作用是使DNA两条链的氢键断开；DNA聚合酶将单个脱氧核苷酸加到已有的单链片段的3′端上，需要模板；DNA连接酶连接的是两条DNA片段的缺口，不需要模板。1．PCR过程与细胞内的DNA复制过程相比，主要有两点不同，它们是(

)①PCR过程需要的引物是人工合成的单链DNA或RNA

②PCR过程不需要DNA聚合酶③PCR过程中DNA的解旋不依靠解旋酶，而是通过对反应温度的控制来实现的④PCR过程中，DNA不需要解旋，直接以双链DNA为模板进行复制A．③④

B．①②C．①③ D．②④解析：PCR过程与细胞内的DNA复制过程相比较，主要有两点不同：(1)PCR过程需要的引物是人工合成的单链DNA或RNA，长度通常为20～30个核苷酸。(2)PCR过程中，DNA解旋不依赖解旋酶，而是通过对反应温度的控制来实现的。答案：C二、PCR扩增的产物及常见问题1．PCR扩增产物可分为长产物片段和短产物片段两部分。短产物片段的长度严格地限制在两个引物链5′端之间，是需要扩增的特定片段。短产物片段和长产物片段是由于引物所结合的模板不一样而形成的，以一个原始模板为例，在第一个反应周期中，以两条互补的DNA为模板，引物是从3′端开始延伸，其5′端是固定的，3′端则没有固定的止点，长短不一，这就是“长产物片段”。进入第二周期后，引物除与原始模板结合外，还要同新合成的链(即“长产物片段”)结合。引物在与新链结合时，由于新链模板的5′端序列是固定的，这就等于这次延伸的片段3′端被固定了止点，保证了新片段的起点和止点都限定于引物扩增序列以内，形成长短一致的“短产物片段”。不难看出“短产物片段”是按指数倍数增加的，而“长产物片段”则以算术倍数增加，几乎可以忽略不计，这使得PCR的反应产物不需要再纯化，就能保证足够纯的DNA片段供分析与检测用。 细胞内RNA和蛋白质的合成是从头合成的。2．PCR的常见问题PCR实验很容易出现假阳性(检测非目的片段的扩增，而未检测出目的片段的扩增)或假阴性(未检测出任何片段的扩增)的结果。出现假阴性结果的常见原因有：TaqDNA聚合酶活力不够或其活性受到抑制；引物设计不合理；提取的模板质量或数量不过关以及PCR系统的建立欠妥当；循环次数不够等等。

当实验中出现假阴性的情况时，应首先在原来扩增的产物中再加入TaqDNA聚合酶，并增加5～10次循环。为了防止假阴性结果的出现，在选用TaqDNA聚合酶时，要注意用活力高、质量好的酶。同时，在提取DNA模板时，应特别注意避免提取物中含有抑制酶活性的污染物，如酚、氯仿等的存在。尽管TaqDNA聚合酶对模板纯度的要求不高，但也不允许有机试剂的污染。PCR扩增的先决条件以及特异性的高低，很大程度上取决于引物与靶DNA的互补情况，尤其需要保证引物的3′端与靶基因互补。PCR技术高度灵敏，极其微量的靶基因污染都会造成非目标DNA片段的大量扩增，因此模板DNA的污染是PCR假阳性结果的主要原因。此外，样品中存在靶基因的类似序列也可能造成假阳性结果。为了避免因污染而造成的假阳性结果，PCR操作时要注意做到：隔离操作区，分装试剂，简化操作程序，使用一次性吸头等。3．PCR扩增数目的理论计算理论上DNA扩增呈指数增长，若只有一个DNA模板，则复制n次后有2n个DNA；若一开始有m个DNA模板，则复制n次后有m×2n；个DNA。实际操作过程中，由于无关变量的影响，一般来说，实验值要略小于理论值。2．在PCR扩增的实验中，加入一种提取物(一种模板DNA片段)，但实验得到的产物却有2种DNA。其原因可能是(

)A．基因突变 B．TaqDNA聚合酶发生变异C．基因污染 D．温度过高解析：实验产物中有2种DNA，说明提取物被外源基因污染。答案：CPCR原理及条件

近十年来，PCR技术(多聚酶链式反应)成为分子生物学实验室里的一种常规手段，其原理是利用DNA半保留复制，在试管中进行DNA的人工复制(如图)，在很短的时间内，将DNA扩增几百万倍甚至几十亿倍，使实验室所需要的遗传物质不再受限于活的生物体。

(1)加热使DNA双链打开，这一步是打开__________键，称为__________。(2)当温度降低时，引物与模板__________端结合，在DNA聚合酶的作用下，引物沿模板延伸，最终合成两个DNA分子，此过程中原料是_________，遵循的原则是_________。(3)PCR技术的必要条件，除了模板、原料、ATP、酶以外，至少还需要三个条件，即：液体环境、适宜的__________和__________，前者由PCR仪自动调控，后者则靠__________来维持。(4)DNA的复制需要引物，其主要原因是__________。A．可加快DNA的复制速度B．引物可与DNA母链通过碱基互补配对结合C．引物的5′端有助于DNA聚合酶延伸DNA链D．DNA聚合酶只能从3′端延伸DNA链解析：本题考查体内DNA复制与PCR技术的原理以及基本条件。(1)PCR技术利用热变性原理使DNA双链间的氢键断裂，称为变性。(2)PCR技术扩增DNA与细胞内DNA复制所需原料一样，为腺嘌呤脱氧核苷酸、鸟嘌呤脱氧核苷酸、胞嘧啶脱氧核苷酸、胸腺嘧啶脱氧核苷酸，遵循的原则是碱基互补配对原则。引物与模板的3′端结合后，DNA聚合酶才能发挥作用。(3)PCR技术与体内DNA复制不完全相同，除了需要模板、原料、ATP、酶以外，至少还需要液体环境、适宜的温度和酸碱度，适宜的温度靠PCR仪自动调控，而适宜的酸碱度靠缓冲液来维持。