《酶工程制药技术》课件-酶的分子修饰

Chapter5

ModificationofEnzymeMolecule酶的分子修饰Contentsofchapter31、什么是酶分子修饰2、酶分子修饰的基本要求和条件3、酶分子的修饰方法4、酶修饰后的性质变化5、酶分子修饰的应用

5.1什么是酶分子修饰？定义通过各种方法使酶分子的结构发生某些改变，从而改变酶的某些特性和功能的技术过程称为酶分子修饰。结构决定功能5.1什么是酶分子修饰？意义增强酶的稳定性stability提高酶的活力activity降低或消除酶的抗原性immunologicalproperty研究和了解酶分子中主链、侧链、组成单位、金属离子和各种物理因素对酶分子空间构象的影响structure5.2酶分子修饰的基本要求和条件基本要求对酶分子进行修饰必须在修饰原理、修饰剂和反应条件的选择以及酶学性质等方面都要有足够的了解。

酶的稳定性酶活性中心的状况5.2酶分子修饰的基本要求和条件基本条件尽可能在酶稳定条件下进行，并尽量不破坏酶活性功能的必需基团，使修饰率高，同时酶的活力回收高。

注意：pH与离子强度修饰反应的温度与时间反应体系中酶与修饰剂的比例5.3酶分子的修饰方法4.3.1金属离子置换修饰4.3.2大分子结合修饰(共价/非共价)4.3.3侧链基团修饰4.3.4肽链有限水解修饰4.3.5氨基酸置换修饰4.3.6酶分子的物理修饰5.3.1金属离子置换修饰定义把酶分子中的金属离子换成另一种金属离子，使酶的特性和功能发生改变的修饰方法。除去其所含的金属离子，丧失其催化活性；重新加入原有的金属离子，催化活性可以恢复或者部分恢复；用另一种金属离子进行置换，使酶呈现出不同的特性。5.3.1金属离子置换修饰过程

（1）酶的分离纯化

除去杂质，纯度

（2）除去原有的金属离子

加入一定量的金属螯合剂

（3）

加入置换离子

加入一定量的另一种金属离子，一般都是二价金属离子。5.3.1金属离子置换修饰适用性

只适用于那些在分子结构中本来含有金属离子的酶。举例α-淀粉酶（杂离子型——钙型）

SOD（Fe2+——Mn2+）5.3.2酶的大分子修饰定义采用水溶性大分子与酶的侧链基团共价结合，使酶分子的空间构象发生改变，从而改变酶的特性与功能的方法

修饰剂可溶性大分子

聚乙二醇、右旋糖苷、蔗糖聚合物5.3.2酶的大分子修饰过程

（1）修饰剂的选择根据酶分子的结构和修饰剂的特性选择

（2）修饰剂的活化

（3）修饰共价键结合

（4）分离凝胶层析，不同修饰度的酶分子5.3.2酶的大分子修饰

举例

聚乙二醇修饰超氧物歧化酶酶半衰期相对稳定性天然SOD

6min

1右旋糖酐-SOD

7h

70

Ficoll(低分子量)–SOD

14h

140

Ficoll(高分子量)–SOD

24h

240聚乙二醇-SOD

35h

350右旋糖酐修饰核糖核酸酶右旋糖酐修饰胰凝乳蛋白酶5.3.3酶分子的侧链基团修饰定义采用一定的方法（一般为化学法）使酶蛋白的侧链基团发生改变，从而改变酶分子的特性和功能的修饰方法。

酶蛋白的侧链基团是指组成蛋白质的氨基酸残基上的功能团，包括氨基、羧基、巯基、胍基、酚基、咪唑基、吲哚基等。5.3.3酶分子的侧链基团修饰作用

提高酶活性；增加稳定性；降低抗原性；引起酶催化活性、功能的改变；获得自然界原来不存在的新酶种。5.3.3酶分子的侧链基团修饰催化活性/非催化活性基团的修饰对非催化基团修饰可改变酶的动力学性质，改变酶对特殊底物的束缚能力。经常被修饰的残基是： 亲核的Ser、Cys、Met、Thr、Lys、His亲电的Tyr、Trp对催化活性基团可以通过选择性修饰侧链成分来实现氨基酸的取代。5.3.3酶分子的侧链基团修饰常见基团的化学修饰反应：羧基5.3.3酶分子的侧链基团修饰常见基团的化学修饰反应：氨基5.3.3酶分子的侧链基团修饰常见基团的化学修饰反应：巯基5.3.3酶分子的侧链基团修饰常见基团的化学修饰反应：咪唑基5.3.3酶分子的侧链基团修饰常见基团的化学修饰反应：酚羟基5.3.3酶分子的侧链基团修饰常见基团的化学修饰反应：胍基5.3.3酶分子的侧链基团修饰常见基团的化学修饰反应：吲哚基5.3.4酶蛋白主链修饰

(肽链有限水解修饰)定义利用酶分子主链的切断和连接，使酶分子的化学结构及其空间结构发生某些改变，从而改变酶的特性和功能的方法。主要是靠酶切/酶原激活法。胃蛋白酶原的激活胰蛋白酶原（trypsinogen）的激活胰凝乳蛋白酶原（chymotrypsinogen）的激活5.3.5氨基酸置换修饰方法化学修饰方法

定点突变技术（sitedirectedmutagenesis）

——在DNA序列中的某一特定位点上进行碱基的改变从而获得突变基因的操作技术。5.3.5氨基酸置换修饰酶分子的定点突变基因序列分析、蛋白质结构分析、酶活性中心分析、引物设计进行基因定点突变、酶基因克隆表达、变异特性分析5.3.6酶分子的物理修饰

作用在极端条件下，由于酶分子空间构象的改变而引起酶的特性和功能的变化情况。特点不改变：酶的组成单位及其基团，酶分子的共价键在物理因素的作用下，副键发生某些变化和重排。5.4酶修饰后的性质变化

热稳定性——较大的提高

抗原性——PEG在消除酶的抗原性效果比较明显。

各类失活因子的抵抗力——修饰酶对蛋白酶、抑制剂均有一定的抵抗能力，从而提高其稳定性

半衰期——有效延长

最适pH——发生了变化

Km的变化——Vm没有明显变化，Km值变大5.5酶分子修