《酶工程制药技术》课件-左旋多巴

左旋多巴（Levodopa）酶工程的应用开篇本文介绍目前研究得最多的同时也是争议最大的具有神经保护潜能的药物——左旋多巴。左旋多巴是治疗帕金森氏病的有效药物之一。理化性质左旋多巴鉴定研究进展合成目录♠提取♠用途♠检识方法♠理化性质具有临二酚结构，性质不稳定，极易被空气中的氧气氧化变质。水溶液久置后，可变黄、红、紫，直至黑色，高温、水、光、碱、重金属可加速其变化。鉴定方法一方法二本品溶于0.1mol/L盐酸溶液中，遇三氯化铁溶液显绿色，将该溶液分两份，一份加稀氨水显紫色，另一份加过量的氢氧化钠溶液显红色。本品水溶液加1%茚三酮溶液加热显红色。研究进展60年代末，国外一些学者开始致力于微生物酶法合成L-DOPA的研究。70年代初，日本学者Yamada等对微生物酶法合成L-DOPA进行了深入的研究，通过菌种选育及发酵条件的优化于1993年在味之素公司投入工业化生产。目前国外L-DOPA的产率超过100mg/ml.80年代后期，武汉大学的彭珍荣等在国内首先开展了微生物法合成L-DOPA的研究，但至今国内尚未有工业化的报道。虽然现在国内有多家制药厂生产L-DOPA及其药剂，但大都是从植物中提取的。L-DOPA的合成

L-DOPA的化学合成

利用基因工程菌合成L-DOPA从植物中提取L-DOPA1911年人们首次利用3，4-碳酰二氧苯甲醛为原料化学合成多巴，后来人们还利用胡椒醛、香草醛、儿茶酚、酪氨酸来合成L-DOPA。国内还有人用的D-麻黄碱拆分N-乙酰-3-（3，4-二甲氧基苯）-DL-丙氨酸来合成L-DOPA，90年代初人们开始运用基因工程的手段获取TPL的基因片段，然后连接到不同的载体中让其在宿主细胞中高效表达。植物中的天然DOPA都是L-型的。目前，从植物中撮L-DOPA由于受到原料来源的限制，产量小，远不能满足市场需求。70年代初，国外化学合成多巴的产量已达150吨。虽用化学法合成多巴的途径有许多，但遇到一个主要的困难是合成出来的产品是D-型和L-型的混合物，将二者分开较困难。由于L-DOPA会引起毒性反应，因此医学上需控制它的旋光度。1990年，西北大学的孙晓莉用不对称催化法合成L-DOPA，但过程复杂难以工业化。1913年就有人从蚕豆籽苗种豆荚中提取天然L-DOPA，1949年从野生植物藜豆中撮出L-DOPA。国内于1972年从豆科植物藜豆种子中提取L-DOPA获得成功，1974年商品L-DOPA投放市场。从猫豆中提取L-DOPA的得率，从1.5%已提高到3.25%。90年Kurusu.Y等人构建了pGRY30-TPL1质粒，此质粒含有来自Escherichiaintermedia的酪氨酸酚解酶（I）基因。91年Kurusu,Y等人分析了Escherichiaintermedia中TPL结构基因的核酸序列，91年Fukushima.M等人构建了pHTDI质粒，比质粒在E.coli中能高效地表达产生酪氨酸酚解酶。这个质粒产生的酪氨酸酚解酶的量比其亲株Escherichiaintermedia多15倍。91年波兰的Polak.J等人从Cfreundii中提取出TPL基因并构建质粒。92年Hideyuki.S等人对ErwiniaherbicolaAJ2982的TPL基因克隆到E.coli中进行表达，再将培养的细胞转入多巴合成体系中，反应30h后，反应液中多巴含量为105mM（20.7mg/ml）。94年，有人将编码TPL的基因克隆到质粒载体pGY1000和pGY4000中并将其转入E.coli中进行表达，用于L-DOPA的生产。至今，利用基因工程菌合成L-DOPA仍无新进展。L-DOPA的提取为了获得纯净的符合标准的产品，必须有适宜的L-DOPA的提取方法。利用微生物发酵法生产L-DOPA，其最终发酵产物含有许多不溶和可溶性杂质，必须采用适当的方法除去这些杂质，分离出纯净的L-DOPA。从发酵液中提取L-DOPA的一般步骤为（1）离心去掉菌体等不溶物（2）采用适当方法除去一些可溶性杂质，有必要还需脱色（3）浓缩得到结晶，再采用一定的方法纯化，得到纯净的晶体。以L-酪氨酸为底物用微生物发酵法生产L-DOPA，最后的发酵产物为棕黑色液体，要从其中提取出纯净的L-DOPA，首先必须进行脱色，活性炭脱色法的人们广为使用脱色方法。但活性炭对各种天然氨基酸具有吸附作用，对芳香族氨基酸表现出最强的吸附力，吸附率达20%左右，因此在L-DOPA提取过程中用活性炭脱色损失较大。近来，有许多研究者研制和寻找新的替代活性炭的脱色剂。L-DOPA的提取HitoshiEnei等TomohisaNagsaki等HitoshiEnei等以活性炭层析法来分离纯化L-DOPA，他们将最终发酵产物的pH用浓盐酸调至1.0，然后酸洗，水洗，最后以氨水洗脱，洗脱液经浓缩后调pH至3.5，得到沉淀以酸碱法重结晶得到纯净L-DOPA，得率56%。TomohisaNagsaki等最终发酵产物用10%HCI调pH至2.5；然后离心去掉菌体等不溶物，上清液经真空浓缩后，用乙酸乙酯洗两次，调pH至4.5，放置过夜得粗结晶，粗结晶用等电点沉淀法纯化两、三次，用热水溶化，重新结晶两次，获得较纯晶体，得率为50%。L-DOPA的提取AddyourtitleKatsujihaneda等Kaiser，A.等Kaiser，A.等用硼酸复合物来提取L-DOPA。SealockR.R和Brenner.M.SealockR.R和Brenner.M.用铅复合物法来提取L-DOPA，但此方法步骤较多，且产品中可能有对人体有害的铅。Blocker.P.等Blocker.P.等用液态离子交换。Katsujihaneda等采用Dowex50-4X（200-400目）H+-型树脂来分离L-DOPA。L-DOPA的提取Micker.D.等日本Micker.D.等发现，在低于30℃的情况下，从过饱和的溶液中结晶出来的L-DOPA为针形晶体，比高于30℃情况下结晶出来的立方形晶体更纯，针形晶体在加热的情况下可变成立方体形晶体。日本在L-DOPA的提取方面作了大量的研究，他们向反应液中添加L-DOPA的无水结晶，在25℃以下继续反应，无水结晶不断析出。反应在25℃以上可析出一水结晶，但向其中加入无水结晶时，析出无水结晶。条件探索可见-紫外分光光度法检识方法高效液相色谱法流动注射分析法高效毛细管电泳法左旋多巴为含有一儿茶酚环的氨基酸,它的芳香环和-COOH结构决定了分子具有一定的紫外吸收,因此分光光度法是一个可供选择的定量方法;而它的儿茶酚结构可以发生氧化还原反应,为电化学检测、比色法和其他衍生化检测奠定了基础;另外,由于左旋多巴具有α-氨基酸结构,因此可应用于氨基酸的分析方法(如:HPLC,HPCE等),也将可以应用于左旋多巴的测定中。L-DOPA薄层色谱法电化学传感器测定法检识方法

Nagaraja等采用可见分光光度法用于测定制剂中儿茶酚胺衍生物多巴胺、左旋多巴、甲基多巴和肾上腺素方法。该法根据儿茶酚衍生物在酸性介质中钼酸根离子存在下与重氮磺胺反应,生成红色产物进行定量,方法稳定,具有良好的灵敏度和准确性。为消除复方制剂中苄丝肼的干扰或同时测定二者的含量,双波长分光光度法常用来消除复方制剂中苄丝肼对左旋多巴的干扰,或同时测定二者的含量。在0.11mol·L-1盐酸介质中,以左旋多巴的最大吸收波长280nm为测定波长,参比波长在264～265nm之间;根据测试条件的不同,测定前需用对照品进一步确定。检识方法测定L-DOPA控释片血药浓度测定狗爪豆中的左旋多巴应用MERCKLichrospher100C18色谱柱（5µm，250mm*4mm）预柱：Nova-PakC18；柱温：35℃；流动相：水相（EDTA0.08mmol/L,KH2PO470mmol/L,庚烷磺酸钠2.08mmol/L）：甲醇（90：10），流速：1.0ml/min。荧光检测：激发波长：278nm，发射波长：325nm，血浆样品用高氯酸沉淀蛋白后直接进样。结果：方法回收率为95.50%～102.55%，最低检测限为0.25ng，日内RSD<4.29%(n=4)，线性范围为0.125～4.0µg/ml。采用ODS柱，以甲醇-0.01mol/LKH2PO4(25:75,pH3.0)作为流动相，巯嘌呤为内标，检测波长280nm。结果：实现实现色谱分离,左旋多巴浓度在100～1000mg/L范围内线性良好,r=0.9999,加样回收率在100.81%～101.42%之间。左旋多巴保留时间及峰形受流动相pH值影响较大。当pH值为3.7时，保留时间较合适，峰形较好。该法回收率高，操作系统误差小，灵敏度高，重现性好，杂志干扰少。结论:本法简便,

准确,重现性好.检识方法分光光度法检测Marcolino-Junior等利用左旋多巴在固相反应器中与固化在聚酯树脂上的二氧化铅(Ⅳ)进行反应,采用流动注射分光光度法测定片剂中左旋多巴含量,生成的多巴色素在520nm进行测定。线性范围为110×10-4～110×10-3mol·L-1,最低检测限810×10-5mol·L-1。电化学检测Galvez等选择了Fe(Ⅲ)/Fe(Ⅱ),VO-3/VO+2等可逆电对作为药物安培计，用于药物制剂的测定，检测效果良好。酶法结合分光光度法检测Fatibello-Filho等在测定制剂中左旋多巴与卡比多巴时,应用甜马铃薯根粗提取物中存在的多酚氧化酶,将儿茶酚胺类物质氧化成多巴醌,进而继续氧化生成多巴色素,左旋多巴和卡比多巴的氧化产物分别在480和360nm处有强烈吸收,可用分光光度法进行定量。检识方法CE法测定美多芭片剂中的左旋多巴HPCE测定血清中左旋多巴的含量优化了缓冲溶液浓度(50mmol/L的硼砂-HCl缓冲溶液)和pH(pH=8.5)、分离电压(14kV)和进样时间（5s）等条件。在优化的条件下,15min内实现了左旋多巴和羟苄丝肼两种物质的基线分离。左旋多巴在0.06～1.0mg/mL浓度范围内和电泳峰高成线性关系,检出限为0.021mg/mL。运用高效毛细管电泳法,75μm石英熔融毛细管总长75cm(有效长度50cm),缓冲液为20mmol/L硼砂,紫外检测波长280nm,压力进样,电压10kV,温度25℃。结果:测定左旋多巴浓度在5～160mmol/L范围内线性良好,r=0.9958,平均加样回收率97.5%～100.0%。实际样品分析结果表明该方法快速、准确、可靠,有望成为该类药物质量控制的一种有效分析方法。本法简便、高效、快速、灵敏和准确、重现性好的特点,并显示出样品用量少、无污染和自动化运行的优势,可为左旋多巴体内药动学的研究提供可靠的方法。可为左旋多巴临床药动学研究提供参考。检识方法

Percu等采用薄层色谱法在280nm波长处测定了左旋多巴.陈勇等则采用薄层扫描法,在硅胶板上,以正丁醇-冰醋酸-水(4∶1∶2)为展开剂,用0.5%茚三酮乙醇溶液显色,反射式锯齿扫描,扫描波长λs=350nm,测定了药用植物猫豆和黎豆中左旋多巴含量。检识方法

Bergamini等采用屏幕印刷技术开发了一种金电极作为电化学传感器,该法在9.9×10-5～1.2×10-3mol·L-1的范围内,线性关系良好,可用于监测固定溶液和流动系统中的左旋多巴。该方法稳定、灵敏、易于制作和贮存,具有自动化和微型化的潜力。方法成功地用于测定制剂中的左旋多巴,不需进行任何前处理。L-DOPA的用途

多巴的衍生物多巴胺是一种重要的神经递质，但多巴胺不能通过血脑屏障而进入脑组织，而L-DOPA可以通过血脑屏障，在脑组织中可脱羧形成多巴胺，可增加多巴胺含量而达到治疗帕金森氏病的功效。L-DOPA还有其他许多用途，可用来治疗腿多动综合症、肝昏迷、CO中毒、锰中毒和精神病、心力衰竭、溃疡病、脱毛症、调节人的性功能等。L-DOPA的用途保健美容人们发现L-DOPA有抗衰老的神奇功效。在日本有人利用酪氨酸酶将L-酪氨酸转化，经L-DOPA氧化形成黑色素，作为染发的商品出售。L-DOPA是一种在医药卫生、保健美容等诸方面有显著功效的氨基酸衍生物。抗帕金森病左旋多巴在脑内转变为多巴胺，补充纹状体中多巴胺的不足，因而具有抗帕金森病的疗效。用左旋多巴治疗后，约75%的患者获得较好疗效。治疗初期疗效更显。治疗肝昏迷用左旋多巴能在脑内转变去甲肾上腺素。使正常神经活动得以恢复，患者可由昏迷转为苏醒。因不能改善肝功能，作用只是暂时性的。左旋多巴的作用特点是：①对轻症及较年轻患者疗效较好，而重症及年老衰弱患者疗效差；②对肌肉僵直及运动困难疗效较好，而对肌肉震颤症状疗效差，如长期用药及较大剂量对后者仍可见效；③作用较慢，常需用药2～3周才出现客观体征的改善，1～6个月以上才获得最大疗效，但作用持久，且随用药时间延长而递增。最新成果日前，治疗性克隆技术治疗实验鼠帕金森氏症获得成功，如果该技术应用于人类，研究人员相信今后像拳王阿里所患的帕金森氏症有望治愈。治疗实验鼠帕金森氏症获得了成功，专家认为，这是人类向治疗帕金森氏症迈出了重要的一步。

据英国媒体报道，美国凯特林癌症研究所研究人员给患帕金森氏症的实验鼠移植了由其自身皮肤细胞克隆产生的神经细胞，后者能产生神经传导物质多巴胺，结果实验鼠的病情出现明显改善。帕金森氏综合征是一种神经疾病，主要病因是脑中的多巴胺分泌量不足。研究人员称，这种利用治疗性克隆技术治疗帕金森氏症的疗法前景看好，因为移植的神经细胞来自实验鼠自身，不会被实验鼠的免疫系统排斥。美国和日本的科学家能够从24只试验鼠身上提取187种胚胎干细胞，试验结果发现没有排斥反应。胚胎干细胞能生成所有其他细胞和组织。克隆研究者希望，有朝一日能够取一小片皮肤，从中得到胚胎干细胞，然后用于根据患者定制的治疗过程。研究者认为帕金森氏症也许能够用上述技术治疗。帕金森氏症目前不能治愈，原因是某些脑细胞受到了损害。目前治疗帕金森氏症的方法中，有一种是移植脑细胞。干细胞研究者认为，克隆技术也许能提供更合适的脑细胞。治疗性克隆即利用克隆技术获取人类早期胚胎，但目的不是将胚胎培育成人，而是为了提取全能型胚胎干细胞，然后在合适的条件下，使其发育成为所需的细胞甚至器官，用于治疗人类疾病。最新突破——帕金森氏症有药可救！！没有排斥反应♠展望

随着我国人口老龄化速度的加快，对L-DOPA的需求将迅速增加。而目前国内市场上的L-DOPA来源绝大部分依靠进口，如何能使微生物法合成L-DOPA在国内投入工业化生产是一个急待解决的问题。运用现代生物技术对菌种进行改造，期望获得高效表达酪氨酸酚解酶的菌株对于提高L-DOPA的产率是非常重要的。另外，固定化细胞法的进一步研究，可提高生产的连续性、稳定性、高效性。虽然L-DOPA的提取方法有多种多样，但L-DOPA易于氧化，这样给提取带来许多不便。又由于L-DOPA大都被用作药来治疗帕金森病，因而对此纯度要求很高，这样对下游提取技术提出更高的要求。因此，L-DOPA作为药物被研究开发成为一个世界性的问题，亟待科研工作者的深入研究。结束

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【英文名】LEVODOPATABLETS【药品类别】抗震颤麻痹药【性状】本品为白色或类白色片。【药理毒理】本品为拟多巴胺类抗帕金森病药，左旋多巴为体内合成多巴胺的前体物质，本身并无药理活性，通过血脑屏障进入中枢，经多巴脱羧酶作用转化成多巴胺而发挥药理作用，改善帕金森病症状。由于本品可以增加脑内多巴胺及去甲肾上腺素等神经递质，还可以提高大脑对氨的耐受，而用于治疗肝昏迷，改善中枢功能，使病人清醒，症状改善。【药代动力学】口服后由小肠吸收。空腹服后1~2小时血药浓度达峰值，广泛分布于体内各组织，1%进入中枢转化成多巴胺而发挥作用，其余大部分均在脑外代谢脱羧成多巴胺，故起效缓慢。半衰期（t1/2）为1~3小时，如用外周多巴脱羧酶抑制剂，可减少左旋多巴的用量，使之进入脑内的量增多，并可减少外周多巴胺引起的不良反应。口服后80%于24小时内降解成多巴胺代谢物，主要为高香草酸及二羟苯乙酸，由肾脏排泄，有些代谢物可使尿变红色。原型排出体外约5%，可通过乳汁分泌。【适应症】用于帕金森病及帕金森综合征。【用法用量】口服开始一次250mg，一日2~4次，饭后服用。以后视患者耐受情况，每隔3~7日增加一次剂量，增加范围为每日125~750mg，直至最理想的疗效为止。每日最大量6g，分4~6次服用。脑炎后及老年患者应酌减剂量。【不良反应】常见的不良反应有：恶心，呕吐，直立性低血压，头、面部、舌、上肢和身体上部的异常不随意运动，精神抑郁，排尿困难。较少见的不良反应有：高血压、心律失常、溶血性贫血。【禁忌症】严重精神疾患、严重心律失常、心力衰竭、青光眼、消化性溃疡和有惊厥史者禁用。【注意事项】高血压、心律失常、糖尿病、支气管哮喘、肺气肿、肝肾功能障碍、尿潴留者慎用。有骨质疏松的老年人，用本品治疗有效者，应缓慢恢复正常的活动，以减少引起骨折的危险。用药期间需注意检查血常规、肝肾功能及心电图。【孕妇及哺乳期妇女用药】本品可分泌入乳汁，也会减少乳汁分泌；动物实验表明本品可引起内脏和骨骼畸形。孕妇及哺乳期妇女应禁用。左旋多巴片取本品10片，精密称定，研细，精密称取适量（约相当于左旋多巴30mg），置100ml量瓶中，加盐酸溶液（9→1000）适量，振摇使左旋多巴溶解，用盐酸溶液（9→1000）稀释至刻度，摇匀，滤过，精密量取续滤液10ml，置另一100ml量瓶中，加盐酸溶液（9→1000）稀释至刻度，摇匀，照紫外-可见分光光度法，在280nm的波长处测定吸光度，按C9H11NO4的吸收系数（E1%/1cm）为136-146。计算即得。检识方法（药典方法）帕金森氏病

帕金森氏病又称震颤麻痹，是中老年人最常见的中枢神经系统变性疾病。是一种以震颤、肌强直、运动迟缓和姿势障碍为主要临床表现的神经退行性疾病,主要病因是中脑黑质多巴胺能神经元的进行性减少。其得名是因为一个名为帕金森的英国医生首先描述了这些症状，包括运动障碍、震颤和肌肉僵直。目前其病因仍不清楚，医学界没有治愈该病的有效方法，但科学家正在不断地努力探索。帕金森氏病的治疗现在主要还是综合地运用各种方法来阻止或者是延缓它的发生和发展，效果还是比较好的。左旋多巴又称L-多巴（L-DOPA）化学名：L-3,4-二羟基苯丙氨酸（L-3，4-Dihydroxylphenylalanin）PrintPagePrinttopicshereTransitionalPageBackdrops:-Thesearefullsizedbackdrops,justscalethemup!-CanbeCopy-PastedoutofTemplatesforuseanywhere!CONTENTSAddyourtitleAddyourtitlewelcometousethesepowerpointtemplates,NewContentdesign,10yearsexperiencewelcometousethesepowerpointtemplates,NewContentdesign,10yearsexperienceCONTENTSAddyourtitlewelcometousethesepowerpointtemplates,NewContentdesign,10yearsexperienceAddyourtitlewelcometousethesepowerpointtemplates,NewContentdesign,10yearsexperienceAddyourtitlewelcometousethesepowerpointtemplates,NewContentdesign,10yearsexperienceCONTENTSwelcometousethesepowerpointtemplates,NewContentdesign,10yearsexperiencewelcometousethesepowerpointtemplates,NewContentdesign,10yearsexperienceCONTENTSAddyourtitleAddyourtitleAddyourtitlewelcometousethesepowerpointtemplates,NewContentdesign,10yearsexperiencewelcometousethesepowerpointtemplates,NewContentdesign,10yearsexperiencewelcomet