长春新碱发酵

长春新碱的发酵培养常俊俊植物学专业学号MG1130001肿瘤是一类严重威胁人们生命和生活质量的重大和主要疾病。据报道，每年中国有200万人死于肿瘤，已经占据病人人群1/4的份额，并且这个数据正在逐年攀升，恶性肿瘤已经成为危害我国居民生命的各类疾病中的第一杀手。发达的欧美国家癌症患者的数量更多，联合国癌症署日前指出，到2030年，全球癌症死亡人数将达到每年1700万人，超过目前的两倍。长期以来,寻找抗癌生物资源与天然药物成为各国医药、化学及生物学家的一个共同愿望。

长春花夹竹桃科长春花属，为多年生草本，在中国主要在主要在长江以南地区栽培，花有多种颜色，花朵多，花期特长，从春到秋开花从不间断，所以有“日日春”之美名。

其乳汁中所含生物碱，如长春花碱和长春新碱被提炼出来作为多种癌症如白血病、哈杰金氏症所用的化学治疗药物。纯化的长春新碱中文商品名为维克思丁。全株具毒性需斟酌注意。误食后，会造成白血球减少、血小板减少、肌肉无力、四肢麻痹等症状。长春新碱的结构与性质长春新碱是一种双吲哚型生物碱。分子式C46H58N4O9。存在于夹竹桃科植物长春花中。甲醇中重结晶时为针状结晶。熔点211～216℃，比旋光度＋42°(氯仿)。溶于氯仿、丙酮和乙醇。其硫酸盐熔点284～285℃，－28°(甲醇)；盐酸盐熔点244～246℃(分解)。长春新碱的抗癌机理抗肿瘤作用靶点是微管，主要抑制微管蛋白的聚合而影响纺锤体微管的形成。使有丝分裂停止于中期。还可干扰蛋白质代谢及抑制RNA多聚酶的活力，并抑制细胞膜类脂质的合成和氨基酸在细胞膜上的转运。长春新碱的获取办法

五十年代末发现，长春碱和长春新碱具有抗肿瘤活性，尤其对白血病具有显著疗效。此后从长春花不同部位分离出100多种生物碱。但这些生物碱在植物体内含量低，且植物生长缓慢，资源短缺，限制了抗癌药物的进一步开发。人们转而又进行植物组织培养研究，但植物组培成本高，生产难度大，有效成分含量低，也未能成功应用于生产。长春新碱的发酵培养法一、原理由于植物真菌对植物某些药效成分的形成有重要影响，甚至会产生和其寄主相同或相似的生理活性成分，而且真菌易于培养，可以通过育种手段条件等措施来大幅度提高其有效成分的含量，并便于组织工业化生产。故利用微生物生产抗癌成分前景十分广阔

二、方法1）内生菌的分离按常规无菌操作，取长春花不同部位的叶和茎干，按下列程序表面消毒，自来水冲洗→75%酒精漂洗（3~5分钟）→无菌水冲洗3~4次→0.1%升汞冲洗（10~30s）→无菌水冲洗五次

将上述处理过的叶片和茎在超净台条件下切割成约0.5cm×0.5cm的小片（茎取韧皮部），然后将小片种植于PDA平板上，置28摄氏度温箱培养3到7天后，即见样品切割过的边缘有菌丝生长出，经纯化后转接到PDA斜面上备用。为检查表面消毒是否彻底，可做对照试验，将上述同样处理过的茎叶不做切割，直接种植于PDA平皿上，置于相同的条件下培养，结果对照的茎段周围物任何菌长出，多次重复均如此，证明所分到的菌是韧皮部内部的，不是表面的附生菌。图1分离得到的内生菌菌落75CG3图2

75CG3菌株菌丝形态特征菌丝体纤细，白色，通常带有紫色，该菌可产生两种类型的分生孢子，大型分生孢子呈纺锤形至镰刀形，多孢无色，小型分生孢子单孢无色卵形至椭圆形2)内生菌的培养种子培养基:液体培养基，将纯化菌株接种到液体培养基中培养种子菌,3d后,取5mL

液体种子菌转入发酵罐中发酵。发酵培养基：2.8L和10L小罐发酵方法：以3%接种量将种子培养液接入已灭菌(2.8L小罐进行实罐灭菌,10L罐先空消,再用无菌压缩空气吹干后加入灭过菌的培养基)、冷却的发酵培养基中，100r/min，28℃通风培养16~18d，定期测定发酵液中长春新碱含量、生物量、总糖和pH值。3）长春新碱的鉴定可采用紫外