1.1-DNA重组技术的基本工具概述

烟草据WTO调查：2004年全世界因狂犬病致死人数约5.5万人中国卫生部通报：2004年７月，狂犬病列法定报告传染病死亡数之首。发病死亡率近100%

能产生狂犬病抗体蛋白的转基因每100kg猪或牛的胰腺中仅可提取4~5g。

1979年，美国将人的胰岛素基因重组到大肠杆菌内，实现了细菌生产胰岛素，大大降低了生产成本。治疗糖尿病特效药——

据WTO调查：

2005年全世界约有糖尿病患者1.8亿人，我国约6000万。胰岛素思考：转基因技术实现了一种生物的某些性状在另一种生物中表达。为什么基因可以在其他种类的生物中表达？密码子在生物界是的！DNA(基因)

mRNA蛋白质(性状)转录翻译通用基因工程专题1基因工程的概念别名操作环境操作对象操作水平操作技术基本过程结果DNA重组技术生物体外基因DNA分子水平人类需要的新生物类型和产品剪切→拼接→导入→表达体外DNA重组和转基因等什么叫基因工程？

基因工程，又叫DNA重组技术。是指按照人们的愿望，在DNA分子水平上进行严格的设计，并通过体外DNA重组和转基因技术，赋予生物以新的遗传特性，从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。专题一基因工程“分子手术刀”──限制酶

“分子缝合针”──DNA连接酶

“分子运输车”

──基因进入受体

细胞的载体

§1DNA重组技术的基本工具HHHAHC一、“分子手术刀”

——限制性核酸内切酶12345作用：从特定部位的两个核苷酸之间切开

（磷酸二酯键）12345提示：原核生物在长期的进化过程中产生的保护机制，可防止外源DNA的入侵而灭绝。1.限制酶从哪里寻找？Why？思考2.为什么细菌中限制酶不剪切细菌本身的DNA？不具备这种限制酶的识别切割序列通过对其中的碱基进行甲基化，使限制酶不能将其切开。一、“分子手术刀”

——限制性核酸内切酶

EcoRⅠ黏性末端黏性末端SmaⅠ平末端平末端限制酶所识别的序列的特点：

中心轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向对称重复排列的。（回文对称序列）P7思1EcoRⅠSmaⅠ识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。主要是原核生物约4000种。1、来源：2、种类：3、作用：4、结果：形成两种末端一、“分子手术刀”

——限制性核酸内切酶黏性末端平末端2、分类E.Coli

DNA连接酶T4DNA连接酶1、作用：

将双链DNA片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开了的两个核苷酸之间的磷酸二酯键。二、“分子缝合针”

——DNA连接酶AG

T

AC

AA

A

T

GCGACGUUGUUADNA聚合酶DNA连接酶寻根问底DNA连接酶与DNA聚合酶是一回事吗?为什么?

可把黏性末端之间的缝隙“缝合”起来，E·coliDNA连接酶或T4DNA连接酶

T4DNA连接酶还可把平末端之间的缝隙“缝合”起来，但效率较低T4DNA连接酶DNA聚合酶DNA连接酶区别1区别2相同点寻根问底DNA连接酶与DNA聚合酶是一回事吗?为什么?1)只能将单个核苷酸连接到已有的核酸片段上，形成磷酸二酯键形成磷酸二酯键1)在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键2)以一条DNA链为模板，将单个核苷酸通过磷酸二酯键连接成一条互补的DNA链2)能将DNA双链上的两个缺口同时连接起来，不需要模板查询：P7思4三.“分子运输车”——基因进入受体细胞的载体⒈载体需要的条件：⑴有1~多个限制酶切点⑵对受体细胞无害⑶导入基因能在受体细胞中复制、表达⑷有某些标记基因，便于筛选⒉常用运载体：⑴质粒⑵病毒——

包括植物病毒、动物病毒和细菌病毒（噬菌体）

⑶假如目的基因导入受体细胞后不能复制或不能转录，转基因生物能有预想的效果吗？⑴作为分子运输车——载体，如果没有切割位点将会怎样？⑵霍乱菌的质粒多个限制酶切点，你会用它来做分子运输车吗？

⑷目的基因有没有进入受体细胞，如何去发现？

（最常用）

质粒是一种裸露的、结构简单、独立于细菌拟核DNA之外，并且有自我复制能力的双链环状DNA分子。能复制并带着插入的目的基因一起复制有切割位点有标记基因的存在，可用含氨苄青霉素的培养基鉴别P7思3

实际上自然存在的质粒DNA分子并不完全具备上述条件，都要进行人工改造后才能用于基因工程操作。

已知标记基因有抗四环素基因和抗氨苄青霉素的基因，现探讨某细菌的质粒中有无标记基因或标记基因是什么？请设计实验、预期实验结果，并得出相应的实验结论。对照组：

不添加抗生素实验组1：添加一定浓度的四环素实验组2：

添加一定浓度的氨苄青霉素试一试对照组实验组1实验组2结论预期一＋＋＋预期二＋＋－预期三＋－＋预期四＋－－对照组：

不添加抗生素实验组1：添加一定浓度的四环素实验组2：

添加一定浓度的氨苄青霉素既含有抗四环素基因也含有抗氨苄青霉素基