N-乙酰-L-半胱氨酸对大鼠胃缺血-再灌注损伤的影响（医学论文）

1/1N-乙酰-L-半胱氨酸对大鼠胃缺血-再灌注损伤的影响（医学论文）N-乙酰-L-半胱氨酸对大鼠胃缺血/再灌注损伤的影响【摘要】目的研究抗氧化剂N-乙酰-L-半胱氨酸(N-acetylcysteine,NAC)对胃缺血/灌注(gastricischemia/reperfusion,GI/R)损伤的影响。

方法采用股静脉注射NAC后，夹闭大鼠腹腔动脉30min，再灌注1h的GI/R模型，计数胃黏膜损伤指数(gastricmucosaldamageindex,GMDI)，测定胃黏膜组织中丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)活性，RT-PCR法检测凋亡相关因子环氧合酶-2(COX-2)的表达。

结果股静脉注射NAC能降低GI/R胃黏膜损伤指数，使胃黏膜组织中MDA含量减少，SOD活性增强，凋亡相关因子COX-2的表达减少。

结论NAC对大鼠GI/R损伤具有保护作用，这种保护作用是通过抑制氧化应激，减少胃黏膜细胞凋亡而实现的。

【关键词】N-乙酰-L-半胱氨胃缺血/再灌注胃黏膜损伤指数超氧化物歧化酶Abstract：

ObjectiveTostudytheeffectofantioxidantN-acetylcysteine(NAC)ongastricischemia/reperfusion(GI/R)inrats．MethodsAfterinjectionofNACintofemoralvein,theGI/Rmodelwasestablishedbyclampingtheceliacarteryfor30mintoinducedischemiaandallowingreperfusionfor1h.Theratswerefinallysacrificedtoinvestigategastricmucosaldamageindex(GMDI),determinethecontentofmalondialdehyde(MDA)andtheactivityofsuperoxidedismutase(SOD)ingastricmucosa.Theexpressionofapoptosis-relatedCOX-2wasdetectedbyRT-PCR.ResultsInjectionofNACintofemoralveincoulddecreasegastricmucosaldamageindex,reducethecontentofMDA,raisetheactivityofSODandinhibittheexpressionofCOX-2ingastricmucosafollowingGI/R.ConclusionNACcanprotectagainstGI/Rinjurybyinhibitingoxidativestressandreducingcellapoptosisingastricmucosa.Keywords：

N-acetylcysteine;gastricischemia/reperfusion；gastricmucosaldamageindex；superoxidedismutase器官缺血/再灌注(ischemia/reperfusion,I/R)时，由于机体氧化系统和抗氧化系统失衡，氧自由基(reactiveoxygenspecies,ROS)产生增多，在体内蓄积过多，使器官组织的细胞膜脂质过氧化，从而造成损伤［1］。

采用抗氧化剂防治器官I/R损伤已经受到了人们的重视。

N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC)是一种抗氧化剂，作为谷胱甘肽(glutathione,GSH)的前体物质，可以减轻I/R造成的机体损伤［2］。

但是NAC对GI/R损伤的影响及其可能的机制，目前尚未见报道。

因此，本实验主要采用股静脉给予NAC后，观察对大鼠胃缺血/再灌注（gastricischemia/reperfusion,GI/R）损伤的影响，测定胃黏膜组织中丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)活性变化及凋亡相关因子环氧合酶-2(COX-2)的表达，并对其机制进行了初步的探讨。

1材料和方法1.1实验药物和试剂NAC购自Sigma公司，SOD和MDA试剂盒购自南京建成生物研究所，cDNA链合成试剂盒和PCR扩增试剂盒购自上海天根生物有限公司，PCR引物购自上海生工生物工程技术服务有限公司。

1.2实验动物和分组成年雄性健康SD大鼠，体重250～300g，由徐州医学院实验动物中心提供。

实验前禁食24h，自由饮水。

实验动物随机分为假手术组（sham组）、胃缺血/再灌注组（GI/R组）、NAC+GI/R组（NAC组），每组6只。

1.3GI/R模型和样本制备实验时动物以10%的水合氯醛(300mg/kg,ip）麻醉，在股静脉给予NAC（150mg/kg）后，按我实验室方法［3］，开腹,分离并夹闭腹腔动脉30min,去除动脉夹恢复血流。

于再灌注后1h处死动物，快速取胃，沿胃大弯剪开，1%冷PBS液冲洗干净，置于冰上展开，计数胃黏膜损伤指数（GMDI）后，留取胃黏膜标本：

剪取一侧胃黏膜于5mlEP管中，低温匀浆分别制成10%和1%的组织匀浆液，置于-20℃冰箱待测SOD、MDA；剪取另一侧胃黏膜于5ml无核酶EP管中，置于-80℃冰箱待测COX-2。

1.4胃黏膜损伤指数的测定按我实验室方法［4］:以胃腺区局限于胃上皮的点状糜烂、溃疡、出血灶的长度累积计分：

正常为0分，损伤lt;1mm计1分，gt;1mm并且2mm计2分，gt;2mm并且3mm计3分，余类推。

损伤宽度超过1mm时分数加倍。

每组大鼠损伤分数的平均值为损伤指数。

1.5MDA含量和SOD活性的测定分别采用硫代巴比妥(TAB)法和黄嘌呤氧化酶法，按照试剂盒中说明书的步骤操作。

1.6凋亡相关因子COX-2表达测定采用RT-PCR法，严格按试剂盒中说明书的步骤提取胃黏膜组织中的RNA和配置反应体系。

COX-2(254bp)：

上游引物5-GCTTCGGGAGCAC-AACAGAG-3,下游引物5-TCAGCGGATGCCAGTGATAGA-3。

-actin(217bp)：

上游引物5-TGTCCCTGTATGCCTCTGGT-3,下游引物5-TTGATGTCACGCACGATTTC-3。

COX-2和-actin的反应条件为：

94℃预变性5min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸2min，30个循环，72℃5min终末延伸，4℃终止反应。

取扩增的cDNA产物9l于1%琼脂糖凝胶中电泳，经凝胶成像系统分析成像，各组COX-2片段与-actin片段的平均光密度（D）比值作为COX-2mRNA的相对量，并进行比较。

1.7统计学处理采用SPSS13.0统计软件，实验数据以s表示，组间比较采用t检验，Plt;0.05有统计学意义。

2结果2.1NAC对大鼠GI/R胃黏膜损伤、胃黏膜组织中MDA含量及SOD活性的影响GI/R组GMDI明显高于sham组（Plt;0.01），NAC组GMDI高于sham组（Plt;0.05）；NAC组GMDI低于GI/R组（Plt;0.05）。

GI/R组MDA含量明显高于sham组（Plt;0.01），NAC组MDA高于sham组（Plt;0.05）；NAC组MDA含量低于GI/R组（Plt;0.05）。

GI/R组SOD活性明显低于sham组（Plt;0.01），NAC组SOD活性低于sham组（Plt;0.05）；NAC组SOD活性高于GI/R组（Plt;0.05）。

见表1。

2.2NAC对GI/R大鼠胃黏膜组织中COX-2表达的影响RT-PCR结果显示：

GI/R组COX-2的表达明显高于sham组（Plt;0.01），NAC组COX-2的表达高于sham组（Plt;0.05），NAC组COX-2的表达低于GI/R组（Plt;0.05）（表2，图1）。

表1NAC对GI/R胃黏膜损伤、胃黏膜组织中MDA含量及SOD活性的影响表2NAC对GI/R大鼠胃黏膜组织中COX-2表达的影响3讨论器官I/R损伤是由于再灌注恢复血流时，ROS生成增多，机体抗氧化能力减弱，进而损伤线粒体，使脂质代谢障碍，并且激活与凋亡相关的信号通路，使I/R组织细胞凋亡增多从而导致组织器官的损伤［5-6］。

因此，治疗器官I/R损伤应从抗氧化方面着手，提高机体的抗氧化能力，减少ROS生成，抑制凋亡信号通路的激活是防治I/R损伤的关键。

有研究报道，NAC作为一种抗氧化剂可以对抗氧自由基对I/R组织的损伤，此外，NAC还可以抑制多种凋亡相关信号通路的激活，减少细胞凋亡。

在心肌再灌注损伤中，NAC可以减少再灌注时ROS的生成，促进ROS清除，同时，NAC还可抑制氧化应激时多种凋亡相关因子和凋亡信号通路的激活，减少心肌I/R时细胞的凋亡［7-11］。

NAC可以增加脑I/R时组织细胞的抗氧化性，减少ROS的生成。

同时，抑制凋亡信号通路的激活，减少氧化应激时脑细胞的凋亡［12］。

综上所述，NAC可以增加I/R损伤时组织细胞的抗氧化性，减少氧化应激早期ROS生成，促进ROS清除，减轻组织损伤。

此外，NAC可以抑制氧化应激时凋亡相关信号通路的激活，抑制细胞凋亡，减轻组织细胞的损伤。

然而NAC是否可以减轻大鼠GI/R损伤？及其相关机制如何？这是我们感兴趣的问题。

本实验发现：

股静脉给予NAC可以使GI/R大鼠胃黏膜组织中的MDA含量减少，SOD活性增加，提高胃黏膜组织的抗氧化性，减轻胃黏膜损伤。

同时，NAC还可以抑制凋亡相关因子COX-2表达，这可能与抑制GI/R损伤时凋亡相关信号通路的激活有关，使胃黏膜细胞凋亡减少，减轻GI/R损伤。

因此我们认为，NAC对大鼠GI/R损伤具有保护作用，其保护作用与抗氧化和抑制细胞凋亡有关，涉及到的具体信号通路，将在以后的实验中继续探讨。

【参考文献】［1］HitomiH,KiyomotoH,NishiyamaA.AngiotensinⅡandoxidativestress［J］.CurrOpinCardiol,2007，22(4):311-315.［2］BandyopadhyayD,ChattopadhyayA,GhoshG,etal.Oxidativestress-inducedischemicheartdisease:protectionbyantioxidants［J］.CurrMedChem,2004,11(3):369-387.［3］胡霞，张咏梅，石玥，等.室旁核内血管紧张素Ⅱ对大鼠胃缺血/再灌注后胃黏膜NF-B表达的影响［J］.徐州医学院学报,2007,27(12):771-775.［4］ZhangYM,WeiEQ,HuX,etal.AdministrationofangiotensinⅡintheparaventricularnucleusprotectsgastricmucosafromischemia-reperfusioninjury［J］.BrainRes,2008,1212(27):25-34.［5］WangQD,PernowJ,SjoquistPO,etal.Pharmacologicalpossibilitiesforprotectionagainstmyocardialreperfusioninjury［J］.CardiovascRes,2002,55(1):25-37.［6］MarczinN,BundyRE,HoareGS,etal.Redoxregulationfollowingcardiacischemiaandreperfusion［J］.CoronArteryDis,2003,14(2):123-133.［7］ZhaoZQ.Oxidativestress-elicitedmyocardialapoptosisduringreperfusion［J］.CurrOpinPharmacol,2004,4(2):159-165.［8］AikawaR,NagaiT,TanakaM,etal.Reactiveoxygenspeciesinmechanicalstressinducedcardiachypertrophy［J］.BiochemBiophysResCommun,2001,289(4):901-907.［9］ClerkA,PhamFH,FullerSJ,etal.Regulationofmitogenactivatedproteinkinasesincar