ER应激蛋白在免疫性关节炎滑膜中的表达

1/1ER应激蛋白在免疫性关节炎滑膜中的表达ER应激蛋白在免疫性关节炎滑膜中的表达#冯利杰1,4，周宬玥2,4，余长亮3，沈玉君4，沈玉先1,4，李俊2*（1.安徽医科大学基础医学院，合肥，230032；2.安徽医科大学药学院，合肥，230032；3.安徽医科大学第一附属医院，合肥，230032；4.安徽医科大学生物药物研究所，合肥，230032）摘要：

目的观察内质网（ER）应激蛋白在免疫性关节炎滑膜组织中的表达，探讨ER应激51015在免疫性关节炎症中的作用。

方法13只雌性新西兰大白兔，随机分为正常对照组和模型组。

模型组兔膝关节腔内注射甲基化牛血清白蛋白（mBSA）诱导免疫性关节炎模型，HE染色观察滑膜组织病理改变；RT-PCR检测滑膜组织中ER应激蛋白BiP、CHOP的mRNA水平；免疫组化和免疫荧光双标检测BiP和CHOP在滑膜组织中的表达和细胞定位。

结果模型组兔出现明显的关节炎症状，病理改变表现为滑膜组织增生，炎性细胞浸润等；巨噬细胞激活的标志性蛋白CD68及成纤维细胞的标志物a-SMA表达明显增多。

在炎性增厚的滑膜，BiP、CHOP表达明显增加，免疫荧光双标结果显示BiP在a-SMA、CD68阳性细胞中均有表达，而CHOP主要在a-SMA阳性细胞表达，在CD68阳性细胞中几乎不表达。

结论免疫性关节炎症能诱导ER应激，CHOP在不同滑膜细胞中的选择性表达可能与滑膜细胞抵抗凋亡有关。

关键词：

免疫性关节炎；内质网应激；未折叠蛋白反应；BiP；CHOP；滑膜细胞中图分类号：

R593.2220Selectivelyexpressedendoplasmicreticulumstressinducibleproteinsinantigen-inducedarthritisFENGLijie1,4,ZHOUChengyue2,YUChangliang3,SHENYujun4,SHENYuxian1,4,LIJun2(1.Instituteofmedical,anhuimedicaluniversity,Hefei,230032;2.Instituteofpharmacy,Anhuimedicaluniversity.hefei,230032;3.ThefirstaffiliatedhospitalofAnhuimeidicaluniversity,hefei,230032;4.Biopharmaceuticalresearchinstitute,Anhuimedicaluniversity,hefei,230032)Abstract:ObjectiveThepurposesofthisstudyweretoinvestigatethecharacteristicsandimplicationofERstress-relativeproteininantigen-inducedarthritis(AIA)model.MethodsAIAmodelwasinducedbyinjectingmBSAandFreund’scompleteadjuvant(FCA)inadultfemalerabbits.Fibroblast-likeandmicrophage-likesynoviocytesinthesynoviumsweredetectedwiththespecificantibodiesofanti--SMAandanti-CD68,respectively.ThemRNAexpressionsofBiPandCHOPweredeterminedbyRT-PCR.ThecellularlocalizationofBiPandCHOPinthesynoviumswasexaminedbydouble-labeledimmunofluorescence.ResultsAIAmodelwasestablishedsuccessfullyand-SMAandCD68expressionremarkablyincreased.BiPwasextensivelyexpressedinbothmicrophage-andfibroblast-likesynoviocytesofinflammatorysynoviums.However,CHOPlocalizedmainlyinfibroblast-likesynovicytes,butfewexpressedinmicrophage-likesynoviocytes.ConclusionERstressinducibleproteinexhibitedselectiveexpressionininflammatorysynovium,whichmaybeexplainwhyinflammatorysynoviocytesresistanttoERstressinducedapoptosis.Keywords:Rheumatoidarthritis;endoplasmicreticulumstress;unfoldedproteinresponse;BiP;CHOP;synoviocyte基金项目：

基金项目：

国家自然科学基金（编号81173074）；高等学校博士学科点专项科研基金项目（编号20093420110002，20113420110004）；安徽省自然科学基金（编号11040606Q14）作者简介：

冯利杰（1980-），女，讲师，功能性蛋白与药物作用靶点.E-mail:fenglijie1128@通讯联系人：

沈玉先，教授，功能性蛋白与药物作用靶点，E-mail：

shenyx@李俊，教授，抗炎免疫药理学，E-mail：

lijun@-1-253035400引言4550类风湿关节炎（rheumatoidarthritis，RA）是一种以关节滑膜炎症为主要病理表现的慢性、系统性自身免疫病，其发病机制十分复杂，至今尚不明确[1]。

内质网应激（endoplasmicreticulumstress，ERstress）是真核细胞的一种保护性应激反应，通过激活未折叠蛋白反应（unfoldedproteinresponse，UPR）通路来减少细胞内错误折叠蛋白的异常聚集，从而起到细胞保护作用[2]。

ER应激与很多因素所致疾病的发生、发展密切相关，越来越多的证据表明，ER应激及UPR通路可能参与了RA的病理过程[3]。

因此，本研究拟在兔免疫性关节炎（antigen-inducedarthritis，AIA）模型上，观察ER应激蛋白在滑膜组织中的表达和细胞定位，为进一步探讨ER应激在RA病理机制中的作用提供理论依据。

1材料与方法1.1材料1.1.1动物5513只新西兰大耳白兔，雌性，体重2.0～2.5Kg，由安徽医科大学实验动物中心提供。

主要试剂1.1.2弗氏完全佐剂（Freund’scompleteadjuvant，FCA），甲基化牛血清白蛋白（methylatedbovineserumalbumin，mBSA）购自Sigma公司；焦碳酸二乙酯（diethypyrocarbonate，DEPC）60购自Amresco公司；TRIzol，逆转录试剂盒购自TaKaRa公司；BiP、CHOP和-actin上下游引物委托上海生物工程有限公司合成；鼠抗CD68抗体购自AbDserotec公司；兔抗CHOP抗体购自SantaCruz公司；鼠抗-SMA抗体、兔抗BiP抗体购自Abcam公司。

1.2方法1.2.1免疫性关节炎模型建立65将mBSA（8mg/ml）与FCA等体积混合，制成混悬液；模型组兔背部多点皮内注射0.5ml抗原混悬液，对照组注射等量生理盐水；14d模型组再次皮内注射0.5ml抗原混悬液；致敏后第28天，模型组兔关节腔内注射0.5ml抗原混悬液（2mg/mlmBSA，溶于5％生理盐水)，对照组注射等量生理盐水[4]；观察兔肢体活动情况，膝关节肿胀程度。

HE染色1.2.270切片常规脱蜡至水，入苏木精3min，0.5％盐酸乙醇溶液分化30s，自来水蓝化20min,70％、80％乙醇溶液各5min，伊红lmin。

梯度乙醇溶液至二甲苯透明，中性树胶封片。

反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）检测滑膜组织中BiP和CHOP的mRNA水平1.2.3分别取正常和炎症滑膜组织，在液氮中磨碎，每50～100mg组织加入1mlTRIzol，用匀浆仪进行匀浆处理。

采用Trizol一步法提取总RNA；紫外分光光度计测RNA产量和纯度。

75根据TaKaRa逆转录试剂盒说明合成cDNA，然后进行PCR。

分别设计并合成BiP、CHOP和-actin的上下游引物（见表1）。

反应条件：

95C预变性5min，94C变性60sec，58C退火60sec，72C延伸60sec，扩增35个循环，72C延伸10min；取PCR扩增产物3ul，加样于1%琼脂糖凝胶，按100V20min电泳，紫外灯下观察PCR产物并拍照。

-2-ABCD分析及Dunnetts检验，P﹤0.05有统计学意义。

80表1.BiP,CHOP,和-actin的RT-PCR引物Table1.PrimersusedforBiP,CHOP,Hrd1and-actininRT-PCRmRNABiPPrimerSenseSequence(5’-3’)Size(bp)GGTATTGAAACTGTGGGAGG275bpAntisenseTTGTCTTCAGCTGTCACTCGSenseGGAGCTGGAAGCCTGGTATGA402bpAntisenseTCCCTGGTCAGGCGCTCGATTTSenseTCACCAACTGGGACGACAT192bpAntisenseGCACAGCCTGGATAGCAACCHOP-actin1.2.4免疫荧光双标记切片常规脱腊至水，微波抗原修复，用含0.5%TritonX-100，5%羊血清的PBS封闭液室温封闭30min，一抗4C孵育过夜；荧光标记的二抗37C避光孵育1h；80%甘油封片。

85用PBS缓冲液替代一抗作阴性对照。

荧光显微镜下观察，摄像。

1.2.5统计学方法计量资料的数据以均数标准差（xs）表示，组间数据的显著性检验采用单因素方差，2结果90951002.1AIA兔滑膜的病理组织学变化光学显微镜下可见正常关节滑膜衬里层由1~2层滑膜细胞组成，且部分不连续，滑膜衬里下层为脂肪细胞，未见炎症细胞浸润（图1A，C）；而模型组滑膜衬里层明显增厚，衬里层细胞由1~2层逐渐增加至10~15层，有较多的乳头样突起（图1B），滑膜下层纤维组织增生，大量炎细胞浸润，脂肪细胞消失，新生血管明显增多，血管周围可见大量淋巴样细胞浸润（图1D）。

图1兔膝关节滑膜组织HE染色Fig.1HEstainingoftherabbitssynovialtissues(A)正常滑膜组织；（B）炎症滑膜组织；（C）A图方框区域放大图片；（D）B图方框区域放大图片。

图中标尺=50m.-3-2.2AIA兔滑膜细胞的激活免疫荧光染色检测滑膜组织中巨噬细胞激活的标志性蛋白CD68及成纤维细胞的标记物-SMA的表达情况，结果发现，正常滑膜组织中CD68和-SMA的荧光强度较弱（图2A和C），而模型组滑膜组织中CD68和-SMA的免疫荧光强度明显增强，提示这两种蛋105白的表达量增加（图2B和D），表明在兔AIA模型中这两类滑膜细胞均被激活。

ACBD图2.AIA兔滑膜细胞中-SMA和CD68的表达Fig.2ExpressionsofCD68and-SMAinsynovialtissueofrabbits免疫荧光染色检测-SMA（A、B）和CD68（C、D）在正常（A，C）和炎症（B，D）滑膜组织中的表达。

图中标尺=100m1101151202.3ER应激蛋白BiP在滑膜组织中的表达和定位BiP是内质网中主要的分子伴侣，其作用是保持底物蛋白处于易于折叠的状态，因此常作为ER应激的标志性蛋白[5]。

我们用抗BiP多克隆抗体对兔滑膜组织进行免疫荧光染色，结果发现，正常滑膜中有少量BiP表达（图3A），而炎性增厚的滑膜组织中BiP表达明显增多，且主要定位于胞浆（图3B）；RT-PCR结果也同样显示，模型组滑膜组织中BiP的mRNA水平明显高于正常对照组（图3C和D），提示炎症能诱导BiP的表达上调。

为了鉴定滑膜组织中表达BiP的细胞类型，我们将BiP分别和CD68、-SMA进行免疫荧光双标，结果发现BiP在-SMA、CD68阳性细胞中均有表达（图4）。

提示炎症能诱导滑膜组织中FLS和巨噬细胞样滑膜细胞（macrophage-likesynoviocytes，MLS）发生ER应激。

-4-125130135图3.BiP在兔滑膜组织中的表达Fig.3ExpressionofBiPinrabbitsynovialtissues(A)BiP在正常滑膜组织中的表达；（B）BiP在炎症滑膜组织中的表达；图中标尺=50m；(C)RT-PCR检测正常和炎症滑膜组织中BiP的mRNA水平；(D)对C图的半定量分析，与正常滑膜组织相比，**P0.01。

图4.滑膜组织中表达BiP的细胞类型Fig.4ThecellularlocalizationofBiPinsynovialtissuesfromAIArabbits(A1-A3)免疫荧光双标检测炎症滑膜组织中a-SMA和BiP的表达；a-SMA(红)，BiP(绿)，A3是A1,A2合并后的图片；(B1-B3)免疫荧光双标检测炎症滑膜组织中CD68和BiP的表达，CD68(红)，BiP(绿)，B3是B1,B2合并后的图片。

图中标尺=50m。

2.4ER应激蛋白CHOP在滑膜组织中的表达和定位核转录因子CHOP是C/EBP家族成员，正常情况下低表达或不表达，ER应激能诱导其表达上调，也常被作为ER应激的标志性蛋白[6]。

免疫荧光染色结果发现，与正常滑膜相比，-5-炎性增厚的滑膜组织中CHOP表达增加（图5B）；RT-PCR结果显示，模型组滑膜组织中CHOP的mRNA水平较正常对照组略有增加（图5C和D）。

提示关节炎症能诱导CHOP表达上调。

同样，为了鉴定滑膜组织中表达CHOP的细胞类型，我们将CHOP分别和-SMA、140145150CD68进行免疫荧光双标，结果发现CHOP只在-SMA阳性细胞中表达，而在CD68阳性细胞中不表达（图6）。

提示CHOP可能在炎症诱导的FLSER应激中起重要作用，而不参与MLS的功能调节。

图5.CHOP在兔滑膜组织中的表达Fig.5ExpressionofCHOPinrabbitsynovialtissues(A)CHOP在正常滑膜组织中的表达；(B)CHOP在炎症滑膜组织中的表达；图中标尺=50m；(C)RT-PCR检测正常和炎症滑膜组织中CHOP的mRNA水平；(D)对C图的定量分析，与正常滑膜组织相比，*P0.05。

图6.滑膜组织中表达CHOP的细胞类型Fig.6ThecellularlocalizationofCHOPinsynovialtissuesfromAIArabbits(A1-A3)免疫荧光双标检测炎症滑膜组织中a-SMA和CHOP的表达；a-SMA(红)，CHOP(绿)，A3是A1,A2合并后的图片；(B1-B3)免疫荧光双标检测炎症滑膜组织中CD68和CHOP的表达，CD68(红)，CHOP(绿)，B3是B1,B2合并后的图片。

图中标尺=50m。

-6-3结论155越来越多的证据表明ER应激以及UPR通路的功能失调与许多炎症免疫性疾病的发生发展有着密切的联系。

大量体外实验证明干扰ER平衡和线粒体代谢的病理因素都可以导致UPR和炎症反应。

而延长的UPR和炎症反应可能相互作用，共同构成一些免疫性疾病，如代谢性疾病，神经退行性疾病，自身免疫性疾病以及感染性疾病的病理基础[7]。

在RA的发生发展过程中，增殖浸润的滑膜细胞和其他炎性细胞均可分泌大量的炎性细160165170胞因子，后者又可诱导滑膜细胞合成各种蛋白，包括细胞因子和蛋白酶，以加重组织的破坏。

这种炎症性的环境不可避免的影响局部细胞ER内的蛋白折叠，并引起错误折叠的蛋白聚集。

另外，RA炎症关节内的长期缺氧也可能诱导ER应激。

已有研究发现RA滑膜细胞核内有ER定位的转录因子ATF6的激活[8]。

因此，我们推测ER应激和UPR信号通路在RA的病理机制中起着重要的作用。

BiP是一类分子伴侣，属于热休克蛋白70（Heatshockprotein70，Hsp70）家族，在非应激状态下，BiP与PERK、IRE1和ATF6结合，封闭了它们的信号传导通路。

当非折叠蛋白在ER内聚集时，BiP被释放出来，并与非折叠蛋白结合，以便阻止非折叠蛋白输出ER[5]。

因此，BiP常被作为ER应激的标志性蛋白。

最近的研究发现BiP在RA滑膜组织中高表达，并选择性刺激滑膜T细胞增殖，80%RA患者血清中存在抗BiP抗体[9]。

在胶原诱导的大鼠关节炎（collagen-inducedarthritis，CIA）模型和进展期骨关节炎病人中也存在类似的结果[10,11]。

此外，外源性的重组人BiP能促进外周血单核细胞中抗炎因子IL-10的表达，抑制TNF-的表达，从而起到抑制炎症的作用[12]。

在本研究中我们发现BiP在炎症滑膜组织中表达上调，且在FLS和MLS中均有表达。

提示免疫性关节炎症能诱导ER应激。

根据以往文献报道，我们推断BiP可能具有抑制炎症的作用，那么如何解释在BiP表达175180185190195上调以及ER应激激活的情况下，炎性滑膜细胞仍然处于高度增殖的状态？我们推测，RA中是否还存在其他调控细胞增殖与凋亡平衡的因素存在，从而影响滑膜细胞的功能。

因此我们检测了CHOP的表达情况。

CHOP属于C/EBP转录因子家族的凋亡前因子，也是公认的ER应激的标志蛋白。

在生理情况下CHOP不表达或低水平表达，ER应激能诱导其表达上调。

CHOP是ER应激与细胞凋亡的重要中间信号分子，CHOP/细胞对ER应激诱导凋亡的敏感性下降[13]。

研究发现CIA鼠FLS中CHOPmRNA和蛋白表达水平降低[14]；用ER应激诱导剂thapsigargin分别处理骨关节病和RA来源的FLS，结果发现，ER应激能导致骨关节病FLS的凋亡，而RA滑膜细胞对ER应激诱导凋亡则不敏感，其原因可能与RA来源的FLS内CHOP表达下调及细胞自噬作用增强有关[15]。

然而，本研究中我们却发现炎症滑膜组织中CHOP表达水平略有增加，并且与BiP的表达特点不同，CHOP仅表达于FLS，在MLS中不表达，说明CHOP的表达与FLS的ER应激有关，而不参与MLS的功能调节；因此我们推测MLS中CHOP的表达缺失可能导致MLS能够避免ER应激诱导的凋亡，从而起到促进炎症的作用。

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