CTC在精准医学中的临床应用

CTC在精准医学中的临床应用液态活检应用于肿瘤防治AllForHealthAllForClinical液态活检循环肿瘤细胞CTC背景介绍循环肿瘤CTC在临床中的应用循环肿瘤CTC捕获及检测对比液态活检PART1肿瘤精准医疗AllForHealthAllForClinical精准医疗／个体化医疗

PrecisionMedicine推动个体化基因组学研究，依据个人基因信息为癌症及其他疾病患者制定个体医疗方案把按基因匹配癌症疗法标准化把找出正确的用药剂量简单化组织活检1.难以获取，量少，无法重复2.具有风险性，可能导致肿瘤细胞扩散3.有创性导致有些病人不愿意接受活检4.组织样本的异质性，不能反应全部肿瘤基因信息液态活检1.仅需外周血，易获取，可重复2.不接触肿瘤组织，无肿瘤扩散风险3.无创，病人易于接受4.可以反应全部肿瘤基因信息液态活检是精准医疗的大势所趋AllForHealthAllForClinical实时便捷及时准确无创液态活检：快速、简便的癌症血液检测方法AllForHealthAllForClinicalMIT：2015十大突破技术——液体活检入选液态活检的检测方法，可以捕获到肿瘤脱落进入血液的肿瘤细胞或DNA，从而替代了从肿瘤本身提取组织。第一次非介入性地，可重复性地抽取肿瘤样本，医生们从而可以建立基因表达谱，靶向突变用药，快速判断治疗是否有效，及随肿瘤的发展而调节治疗方案。《ASCO年度报告：2015临床肿瘤学进展》：将液态活检技术列为肿瘤治疗领域的下一个十年趋势之一液态活检三驾马车AllForHealthAllForClinicalCTC由实体瘤或转移灶释放的进入外周血循环的，完整的肿瘤细胞实时监测，判断预后ctDNA肿瘤细胞释放到血液循环系统中的DNA，片段化的DNA片段早期筛查，个性化用药指导，耐药性分析外泌体活细胞分泌的来源于晚期核内体的膜性囊泡含量大，性质稳定，可用于治疗研究循环肿瘤细胞CTC背景介绍PART2AllForHealthAllForClinicalCTC的发展历史AllForHealthAllForClinical什么是循环肿瘤细胞（CTC,CirculatingTumorCells）

随着实体肿瘤的生长，周围微环境发生了特定的变化时，有一部分肿瘤细胞会获得异常的活动能力（上皮间质转化，EMT）。这些细胞从原发肿瘤上脱落，在身体里寻找新的落脚点。这些肿瘤细胞会搭乘血液系统或淋巴系统去往身体各处，其中经过血液循环的脱落肿瘤细胞就被称为循环肿瘤细胞（CTC,CirculatingTumorCells），在到达适宜的目标时他们又会变成恶性繁殖的机器（间质上皮转化，MET）。这就是肿瘤的血行转移，从原发部位形成继发性肿瘤。AllForHealthAllForClinicalCTC转移途径AllForHealthAllForClinicalCTC的特点想从血液中找到这些细胞难度非常大，每毫升血液里面CTC约1～10个，而白细胞的数量级是106-107，红细胞的数量则更多。

CTC体积大于血细胞，CTC的直径约为10um-20um，而血细胞大小为7-12um。然而随着近年来人们对CTC了解的不断加深，发现很多CTC实际上与白细胞一样大，有些甚至只有白细胞的一半或更小。目前有证据显示，这些小或超小CTC的数目比例在有些瘤种中可高达1/3。CTC特性AllForHealthAllForClinical与血液细胞相比，肿瘤细胞具有以下特征：体积更大；液相流动性更大；细胞膜的电容和电导特性不同；CTC确认标准：DAPI染色阳性；组织来源相关CK染色阳性；CD45染色阴性；肿瘤相关抗原染色阳性（MUC1，HER2，PSAetal.）其它辅助方法：FISH，HE，PCR，EPISPOTEMBOMolMed.2015Jan;7(1):1–11Cell.

201428;158(5):1110-22循环肿瘤细胞临床应用PART3AllForHealthAllForClinicalCTC在临床中的应用AllForHealthAllForClinical在辅助诊断方面，辅助诊断主要是在常规手段无法对早期肿瘤进行判断时进行。例如：肺部小结节患者的活检诊断仅有4%诊断为肺癌，利用CTC检测可以减少筛查人群，提高检出率，在临床中我们发现早期肺癌患者症状多不明显，组织活检也未必能检测到，此时如果CTC检测为阳性，有助于癌症诊断。在疗效评估方面，癌症患者进行化疗、靶向治疗后进行CTC检测，若CTC数量减少，提示治疗方式可能有效，相比于现阶段的CT、MRI等检查手段，CTC检测技术操作更方便，应用更简单，可以更及时地提示医生该患者是否适合化疗或靶向治疗。在术后监测方面。以肺癌为例，肺癌患者手术后约50%可能会复发，术后监测非常关键，之前主要监测手段为患者每隔3或6个月进行CTC等检查，主要是由于活检无法高频次检测。而目前CTC检测在术后监测中应用可能更方便，检测频次会更高。及时检测血液内CTC的变化，在癌症发生的早期就及时进行治疗，能提高患者存活率。CTC在临床中的主要应用CTC临床应用——治疗决策AllForHealthAllForClinical最大的&最成熟的临床应用：预后预测但不应只是一切的终点，而应是一切的开始CTC对接受一线化疗的转移性乳腺癌患者预后具有重要意义，但是针对一线化疗后CTCs仍升高的患者换用其它化疗方案并不能有效地延长患者生存期。CTC的简单计数，并不能反应肿瘤细胞内在的生物学特性，而正是这种特性是决定了不同的肿瘤细胞对治疗具有不同的反应。因此，对CTC细胞的分子特性（例如药物靶向基因的表达，药物耐受相关基因突变的检测）的精细刻画，将有利于充分发掘CTC在指导临床治疗的价值。循环肿瘤细胞捕获及检测方法对比PART4AllForHealthAllForClinicalCTC常用捕获方法对比AllForHealthAllForClinical1.生物化学特性富集法（1）阳性富集法（免疫磁珠吸附CTC）：以CellSearch为代表，在磁珠上包被细胞表面粘附分子EpCAM，来捕获CTC。（2）阴性富集法（免疫磁珠吸附其他细胞）：也称为白细胞去除法。用特异性抗体CD45，CD14等与白细胞结合，从而去除全血中的白细胞。该方法比其它富集方法捕获效率更高，但特异性明显低于其它方法。（3）阳性富集法（微流体法）：将抗CTC表面特定蛋白标示物(EpCAM)抗体与磁珠或微流体进行偶联，利用这些固相载体上的抗体直接从血中捕获CTC。CTC常用捕获方法对比AllForHealthAllForClinical2.物理特性富集法：依据CTC的物理特性，如密度、大小、可变形性及表面电荷等进行富集。（1）密度梯度离心：非常廉价高效的CTC分离方法，可将CTC与白细胞和红细胞分离。目前市场上有较多的依赖密度梯度离心进行CTC富集的试剂盒，如Ficoll-Paquesolution（PharmaciaFineChemicals，Sweden），OncoQuick（GrenierBioOne,Germany）等。临床实验证明，密度梯度离心富集CTC比CellSearch系统效率更高。（2）过滤法：依据CTC体积大于血细胞的特性，对CTC进行捕获。CTC的直径约为10um-20um，而血细胞大小为7-12um，通过过滤，留下体积比较大的CTC。然而随着近年来人们对CTC了解的不断加深，发现很多CTC实际上与白细胞一样大，有些甚至只有白细胞的一半或更小。目前有证据显示，这些小或超小CTC的数目比例在有些瘤种中可高达1/3。（3）微流控芯片：针对CTC的体积和可变形性对CTC进行捕获，CTC的捕获率和特异性均可达到80%以上。CTC常用捕获方法对比优旭CTC捕获方法AllForHealthAllForClinicalCTC国内常见捕获平台对比优旭TM-无创循环肿瘤细胞(CTC)检测

国内唯一一家可以实现从同一管血中检测CTC和ctDNA，两者互补提供更多的临床信息，可开发空间巨大

准确捕获CTC，实现肿瘤细胞的动态监测

最新的液态活检技术，捕获外周血中CTC并进行多平台分析的方式，实现肿瘤患者的预后、复发评估及耐药、疗效检测推广优无需特殊仪器耗材，轻松完成检测，易于产业化优旭™CTC搭建优成本较低，便于临床推广及与ctDNA合用科研方面：单细胞转录组/基因组临床方面：多个marker的表达，SNP、indel、fusion扩展优应用优药物指导，预后评估、动态检测；结直肠癌、前列腺癌、肝癌/胰腺癌性能优高灵敏性、高特异度，达到同行业领先水平AllForHealthAllForClinicalCTC常用检测方法对比AllForHealthAllForClinicalCTC常用检测方法对比

RT-PCR反转录PCR，提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用引物和逆转录酶将mRNA反转录成cDNA。再以cDNA为模板进行PCR扩增，而获得目的基因或检测基因表达。RT-PCR使RNA检测的灵敏性提高了几个数量级，使一些极为微量RNA样品分析成为可能。结合RT-PCR可同时对若干个基因的表达进行检测。位点特异性PCR技术可用于检测CTC携带的驱动基因的突变情况。检测内容：EMT/KRAS/ALDH1/NRAS/CK19/BRAF/Survivin/PIK3CA针对：结直肠癌，前列腺癌，乳腺癌CTC单细胞测序AllForHealthAllForClinical应用：CTC的分子特征实时评估将如何更好地辅助于：肿瘤疗效评估肿瘤转移进展监测和预防肿瘤治疗方案选择挑战：提高CTC的检出率（不依赖抗体的CTC分离策略，CellCullectorTM策略）；准确地判断具有生物学活性/功能的CTC（EPISPOT,CAM等策略）；CTC细胞分离，单细胞核酸WGA操作等样品制备的SOP和QC方案；CTC本身的异质性。AllForHealthAllForClinical单细胞测序技术实例

多重退火和成环循环扩增技术（MultipleAnnealingandLooping-BasedAmplificationCycles,MALBAC）主要研发人：哈佛大学终身教授、美国科学院院士谢晓亮（SunneyXie）教授技术看点：降低PCR扩增偏倚，使得单细胞中93%的基因组能够被测序。这种方法使得检测单细胞中较小的DNA序列变异变得更容易，因此能够发现个别细胞之间的遗传差异。这样的差异可以帮助解释癌症恶化的机制，生殖细胞形成机制，甚至是个别神经元的差异机制。技术简介：PCR扩增具有偏好型而且基因组具有大量的冗余，造成了基因组测序准确性不高。谢晓亮研发的MALBAC技术能从一个细胞的基因组中，分离出来自单细胞的DNA，然后添加称作引物的短DNA分子。这些引物可与D