基因诊断与基因治疗

基因诊断与基因治疗第一节基因诊断疾病的根本原因:

疾病的各种表型的改变是基因的改变造成的基因诊断:

采用分子生物学的技术方法来分析受检者的某一特定基因的结构(DNA水平)或功能(RNA水平)是否异常，以此来对相应的疾病进行诊断。是病因的诊断。一、基因诊断(GeneticDiagnosis)的含义二、基因诊断的原理和方法1、基因诊断的原理：DNA诊断----检测相关基因的机构及其表达功能特别是RNA产物是否正常。RNA诊断----对表达产物mRNA质和量表化的分析。1、基因诊断的方法核酸分子杂交技术聚合酶链反应(PCR)基因测序基因芯片（1）DNA诊断斑点杂交等位基因特异寡核苷酸探针

(allelespecificoligonucleotide,ASO)PCR/单链构象多态性分析（SSCP）

(singlestrandconformationpolymorphism,SSCP)限制性内切酶谱分析法DNA限制性长度多态性

(restrictionfragmentlengthpolymorphism,RLFP)分析PCR/单链构象多态性分析（SSCP）PCR产物变性后，经聚丙烯酰胺凝胶电泳，正常基因和变异基因的迁移位置不同，可分析确定致病基因的存在。

×MstⅡ酶切位点(GCTNAGG)5´3´正常基因5´3´突变基因1.15kb1.35kb镰状红细胞贫血患者基因组的限制性酶切分析+﹣0.2kb1.15kb1.35kb正常人突变携带着患者镰状红细胞贫血患者基因组的限制性酶切分析（2）RNA诊断RNA印迹（Northenblot）是检测基因是否表达、表达产物mRNA的大小及基因表达的效率。RT-PCR三、基因诊断的应用1、遗传疾病2、感染性疾病（1）病毒性感染（2）细菌性感染（3）寄生虫（4）其他3、恶性肿瘤4、法医学中的应用（1）DNA指纹分析（DNAfingerprinting）（2）短串联重复多态性分析（shorttandemrepeat，STR）遗传性疾病----DMD的分子诊断

遗传性疾病----DMD的分子诊断X染色体连锁隐性遗传性肌肉疾病,发病率为1/3500个男孩DMD基因位于Xp21.2-21.3，全长2500KbDMD基因的突变导致dystrophin缺陷检测DMD基因的技术：

Southern印迹、多重PCRDMD的基因检测

迪谢内肌营养不良(DMD)是一种高发病率、高致残、高致死的X染色体连锁的遗传性疾病，在2500个活产男婴中即有一个患者。致病基因DMD的全长为250kb，有79个外显子。

DMD的最主要遗传缺陷是外显子缺失，约占60%~70%。DMD基因外显子缺失的检测感染性疾病的分子诊断感染性疾病的分子诊断

定性或定量检测致病微生物的核酸，已经用于病毒、细菌和寄生虫感染的诊断。动态、定量地检测病原体核酸能对疗效判断和病情预后提供客观的依据。

SARS相关冠状病毒的分子诊断SARS相关冠状病毒的分子诊断

2003年4月，香港研究者Peiris等报告了50例SARS病人的临床表现和病毒学研究结果证明，新冠状病毒可能是SARS的致病原因。（Lancet,2003,361:9365)

其它实验室陆续得出相同结论。

2003年4月，德国汉堡Bernhard-

Nocht热带医学研究所学者Drosten

等用随机扩增技术，获得长度为

300bp的核苷酸序列。根据这段序列，建立了检测新冠状病毒的常规和实时定量PCR技术。（onApril10,2003）引物和探针

BNIoutS2--BNIoutAsBNI-1片段，189bp

BNIinS--BNIinAsBNI-1片段的内套片段，108bpBNITMSARS1—BNITMSARAs2BNITMSARP(荧光素标记的探针）产物长度：77bp

检测标本痰液、咽拭子、鼻拭子、支气管肺泡灌洗液、血浆、粪便。检测方法

1.逆转录-巢式PCR2.逆转录-实时PCR结果

病人和接触者（具临床症状）的痰液中用外套引物检测到了病毒。病人的其它标本用套式PCR检测到病毒。

有报道显示，在可能SARS病人中，病毒的检出率为100%。在疑似SARS病人中的检出率为

23%。所有健康接触者中未检测到病毒。

检测病毒的3种方法（血清学检测、病毒分离、PCR技术）中，PCR技术的检出率最高。讨论

疾病的早期即可获得阳性结果（早于血清转换期）。特异性较高（SARS患者中的阳性率约为80%，对照中的阴性率约为

98%~100%）。现有的方法敏感性较差，阴性结果不能排除病毒感染。讨论痰液中病毒RNA浓度极高，说明病毒从呼吸道排放是主要传播途径。血清中检测到极低浓度的病毒RNA，提示病毒复制不仅发生于呼吸道。病人恢复晚期的粪便中存在病毒RNA，说明粪便可能也是一种传播途径。鼻、咽拭子中含有的病毒RNA显著少于痰液，提示不适合作为标本（有可能漏检）。SARS相关冠状病毒分子诊断中

必须注意的问题必须在规范的基因扩增实验室中进行。应采取必要的质控规程，包括阳性对照和阴性对照。阳性结果时必须对原始样本重复检验或者扩增基因的另一个片段或在另一个实验室对同一样本进行检测。其他感染性疾病的诊断HBV病毒HIV病毒

PCR技术在细菌性食物中毒中的应用简介细菌性食物中毒具有下列特点：与饮食有密切关系，患者只局限在食用过同一种食物的人群中，去掉原因食品后，不再有新患者；临床症状以急性胃肠炎为主要表现，症状基本相同；短时间内有多人发病；无人传染人的现象；有一定的地区性，主要与人们膳食习惯有关；有明显的季节性，主要发生在夏秋季节，气温高细菌易于繁殖和产生毒素；从病人与食物中可分离出相同的病原菌。简介细菌性食物中毒感染型食物中毒：由于细菌污染食物后在其中大量繁殖，人食入了含有大量活菌的食物后，引起消化道感染而造成的中毒，如沙门氏菌、副溶血性弧菌、变形杆菌、链球菌等。毒素型食物中毒：由于细菌污染食物后在其中繁殖并产生大量毒素，人食入含有大量毒素的食物后引起的中毒，如肉毒中毒。样品采集剩余食物炊事用具呕吐物粪便外环境样品常规检验程序(1-2星期)直接涂片、染色、镜检活菌数测定（少数菌）选择适当的增菌鉴别培养基进行分离培养生化鉴定血清学试验毒素测定常见的致食物中毒的细菌沙门菌志贺菌O157副溶血性弧菌金黄色葡萄球菌蜡样芽孢杆菌霍乱弧菌单核利斯特菌化脓性链球菌小肠结肠耶尔森氏菌变形杆菌空肠弯曲菌产气荚膜梭菌致腹泻性大肠杆菌样品增菌直接处理选择性培养基增菌DNA提取PCRPCR快速检测致食物中毒的细菌M肿瘤相关基因的检测肿瘤相关基因的检测

肿瘤是由于遗传物质（肿瘤相关基因）发生突变而导致的疾病。肿瘤相关基因的突变只是增加了个体对肿瘤的易感性而并不一定马上产生肿瘤，肿瘤的发生是一个多因素、多步骤的过程。生物芯片技术在今后的肿瘤发病机制研究和肿瘤的诊断等方面将发挥越来越显著的作用P53导致肿瘤发生的机制TotalRNAfromHeLaorNCI-H23cellswerereverse-transcribedintocDNAsinthepresenceofBiotin-dUTP.Thebiotin-labeledcDNAprobeswerethenhybridizedindividuallytotheHumanTranSignalp53TargetGeneArray.p53TargetGeneArray法医学上的应用个人认识亲子鉴定性别鉴定第二节基因治疗一、基因治疗的概念1、基因治疗的定义：从基因角度：对缺陷的基因进行修复将正常有功能的基因置换增补缺陷基因从治疗角度导入基因以改变患者细胞的基因表达导入基因：缺陷基因相对应的有功能的同源基因缺陷基因无关的治疗基因基因治疗的两种形式体细胞基因治疗种系基因治疗只限于某一体细胞的基因的改变只限于某个体的当代对缺陷的生殖细胞进行矫正当代及子代2、基因治疗的方式基因矫正或置换基因增补基因封闭其他3、导入的方式体外导入（exvivo）体外将基因导入细胞内再将这种基因修饰过的细胞回输病人体内使这种带外源基因的细胞在体内表达达到治疗或预防的目的体内导入（invivo）外源基因直接导入体内有关的组织细胞使其进入相应的细胞并表达基因治疗的基本程序治疗性基因的选择基因载体的选择靶细胞的选择基因转移外源基因表达的筛选

利用在体中的标记基因回输体内病毒载体非病毒载体体细胞生殖细胞间接体内疗法直接体内疗法二、治疗的基因的选择目前临床试验的治疗基因：

合适的能达到治疗/预防的目的基因的cDNA(表21-1)目的基因的cDNA的获得cDNA文库中目的基因的克隆人工合成基因片段PCR法筛选扩增目的基因

三、载体系统--运送基因的工具病毒载体非病毒载体逆转录病毒载体腺病毒腺相关病毒其他脂质体裸DNA逆转录病毒载体逆转录病毒的生活周期进入宿主细胞

双链RNA

逆转录酶

双链DNA前病毒

整合到宿主细胞基因组DNA中宿主细胞RNA聚合酶IImRNA

病毒RNA基因组作为合成相应

病毒蛋白质的模板包装成新的病毒颗粒，离开宿主LTRgagpolenvφLTR长末端重复序列调节和启动转录产生病毒核心蛋白产生逆转录酶产生病毒外膜蛋白包装信号DNA前病毒的结构特征逆转录病毒载体的构建常用的是莫洛尼小鼠白血病病毒(MoMLV)构建的各类逆转录病毒载体LTRgagpolenvφLTR长末端重复序列调节和启动转录包装信号目的基因标记基因LTRgagpolenvLTRGag蛋白PoL蛋白Env蛋白包装细胞系LTRLTR靶细胞目的基因标记基因LTRφLTR目的基因标记基因12345假病毒颗粒的产生并感染靶细胞逆转录病毒载体重组逆转录病毒(核酸部分只能是逆转录病毒载体)辅病毒四、基因治疗的临床试验当前基因治疗试验：治疗性试验基因标记非治疗性试验治疗性试验1、基因标记2、单基因疾病3、恶性肿瘤（1）免疫基因治疗（2）自杀基因系统（3）抑癌基因（4）裂解肿瘤病毒4、病毒性感染5、心血管疾病遗传性单基因疾病腺苷脱氨酶(ADA)缺乏的

严重联合免疫缺陷(SCID)腺苷脱氨酶(ADA)缺乏的

严重联合免疫缺陷(SCID)病因:淋巴细胞缺乏ADA酶腺苷、dATP堆积破坏免疫功能