马铃薯种质资源活体培养保存技术规程

1马铃薯种质资源活体培养保存技术规程本文件规定了马铃薯种质资源活体培养技术规程的术语和定义，脱毒材料的选取、培养基制备、茎尖剥离、组织培养、病毒检测等技术规程。本文件适用于马铃薯种质资源活体离体保存。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T18133-2012马铃薯种薯NY/T401-2000脱毒马铃薯种薯（苗）病毒检测技术规程3术语和定义下列术语和定义适用于本标准。3.1外植体指从健康完整的马铃薯块茎上选取的用于茎尖培养的幼芽段。3.2茎尖剥离应用茎尖分生组织培养技术，选取马铃薯芽顶端部分（直径0.1mm～0.3mm），带有1～2个叶原基的茎尖分生组织，移植到诱导培养基中培养。3.3脱毒试管苗经马铃薯病毒病检测后，确认不携带马铃薯X病毒（PVX）、马铃薯Y病毒（PVY）、马铃薯S病毒（PVS）、马铃薯A病毒（PVA）、马铃薯M病毒（PVM）、马铃薯卷叶病毒（PLRV）这6种病毒以及马铃薯纺锤块茎类病毒（PSTVd），同时不带任何细菌、真菌的试管苗。3.4离体保存选取马铃薯茎尖、茎段或其他离体组织通过无菌操作接种在特定的培养基上，在人工控制条件下进行培养，已获得的完整植株可保持其体内所含遗传物质的完整性，从而达到保存目的的方法。4茎尖剥离（脱毒）材料的选取24.1选用植株进行培养时，应选取健壮且具备品种（系）典型农艺性状植株的顶芽、腋芽或茎段作为材料。4.2选用块茎进行培养时，先从田间种植的种质资源中选择生长健壮、没有明显病毒症状、具有品种（系）典型的农艺性状的植株，用挂牌做好标记，到收获时取其所结的块茎作为离体保存材料。5类病毒(PSTVd)检测对于入选的植株或薯块按照GB/T18133-2012、NY/T401-2000规定的方法进行PSTVd检测，筛选出不含有PSTVd的植株或块茎。6脱毒与培养6.1脱毒材料的预处理6.1.1从田间选取的植株需要移植到装有无菌土的塑料盆中，让植株生长一段时间，培养期间应定期喷洒杀菌剂于植株上。6.1.2块茎催芽将选取的块茎放置于恒温培养箱中，温度35℃,每d光照16h，光照强度2000lx，放置约30d后，用赤霉素溶液（浓度在百万分之十至百万分之二十）浸泡20min~30min，做催芽处理。6.2脱毒培养基的制备6.2.1常规配制方法有2种即：MS+萘乙酸0.5mg/L+6-苄氨基腺嘌呤0.1mg/L或者MS+萘乙酸0.2mg/L。2种配制方法其最终培养基的pH值调节在5.8~6.0.6.2.2将配制好的培养基分装于试管或培养器皿中，盖好盖子。6.2.3将分装好的培养基放入高压蒸汽灭菌锅内，温度在121℃条件下、灭菌25min~30min。灭菌完毕后，先冷却，在操作前送往超净工作台内。6.3脱毒材料的消毒处理6.3.1取材：选取处理过的块茎上2cm左右长的顶芽和侧芽，或选取处理过的植株的顶芽、腋芽或茎段作为脱毒消毒材料。6.3.2清洗：将选取的材料放入玻璃烧杯内，放在水龙头下，采用小水流，用毛刷冲洗尘土，随后在烧杯上扎块纱布，置于流动的小水流下冲洗，持续时间约30min。6.3.3消毒：在超净工作台内，先用75%的酒精浸泡30s，并不断晃动，充分作用；随后用无菌水冲洗3遍，控干水分；再用5%漂白粉溶液中浸泡5min~10min或10%次氯酸钠溶液中浸泡5min~10min；3最后用无菌水冲洗3遍，滤干水分备用。6.4茎尖剥离与接种在40X的立体双筒解剖镜下，用无菌解剖针或无菌刀剥取顶芽、腋芽或茎段的生长点或带有1个~2个叶原基的茎尖分生组织，直径0.1mm~0.3mm，接种到脱毒培养基中进行培养。~6.5茎尖培养条件6.5.2光照长度：白天保持14h，晚上保持10h，光照变化与温度变化同步。6.5.3光照强度：在愈伤组织形成和出生长点时，光照强度在1500lx~2000lx。6.6茎尖成苗每隔3d~5d观察一下，先长出愈伤组织，然后长出生长点，再抽出茎叶，此时应及时剪出生长点，转移到MS培养基上。当发育成3个~4个叶片的小植株后，应单节切断快繁，同时标明该种质资源品种（系）名称或试验室编号，繁3瓶~4瓶，每瓶20株小苗。6.7病毒检测应按照NY/T401-2000规定，针对茎尖剥离的种质资源品种（系）所获得的扩繁苗进行病毒检测，经检测不带有PVX、PVY、PVS、PVA、PVM、PLRV这6种病毒的资源材料进行离体保存。7离体保存7.1试管苗保存7.1.1保存培养基配方MS+3%白糖+3g/L琼脂粉+甘露醇20g/L，pH值5.8~6.0.7.1.2试管苗接种挑选生长健壮的马铃薯试管苗进行剪切，每个茎段带有1片叶子，叶面朝上接种在装有MS培养基的试管内，每支试管接种2株，每份资源材料至少保存10支。7.1.3保存条件先将保存苗放置于温度22℃~24℃、光照强度2000lx~3000lx、光照时间16h/d的条件下培养2周，试管苗生根后将培养温度调节为8℃~10℃、光照时间12h/d、光照强度2000lx~3000lx，持续培养。7.1.4保存方法4在试管苗离体培养过程中定期对培养室进行消毒（紫外线消毒、熏蒸法消毒）防止试管苗二次污染，定期进行试管苗污染检查，若发现污染要及时取出并高温灭菌处理。7.2试管薯离体保存7.2.1保存培养基配方MS+10%白糖+4.5g/L琼脂粉+0.1%活性炭，pH值为5.8~6.0。7.2.2试管薯接种同7.1.2。7.2.3保存条件先将保存苗放置于温度22℃~24℃、光照强度2000lx~3000lx、光照时间16h/d的条件下培养4周，试管苗生根后将培养温度调整为17℃~18℃、光照时间8h/d、光照强度1000lx，进行试管薯诱导，60d后可形成试管薯，待形成试管薯后继续在此条件下培养。7.2.4保存方法同7.1.4。7.3继代培养要定期观察连续保存1年以上的离体保存的试管苗及试管薯的生长情况，若发现试管苗开始变黄、枯萎，或试管薯休眠期已过并在芽眼处生长发育出幼苗，应立即对试管苗进行转接，单节剪切接种到重新配制的、高温灭菌冷却后的MS培养基上，试管薯也同样转接到上述培养基上，转接后在光照培养室培养7d，试管苗开始正常生长、试管薯也能萌发出新的幼苗，待生长状态恢复后再继续保存。8种质资源培养室的日常管理做好所有资源材料离体保存的登记，包括其品种名称、来源、性状以及保存现状。通常不常用的资源材料仅进行继代保存，每份资源材料保留10支试管；主栽品种，特别是需要当季启动生产的品种，先将试管苗进行病毒检测，再在资源库中留取一部分，使种质资源库中始终保持拥有健康无内生菌的试管苗，其余部分进行继代扩繁，用于生产。若遇到淘汰的品种（系），种质资源库将不再留存。9抢救离体保存的种质资源试管苗污染的方法通常接种4d~7d时，开始挑拣污染的试管苗。首先要找到污染的原因，分析是由于接种时环境污染、人员操作不当造成的，