第四章 药物定量分析与分析方法验证

第四章药物定量分析与分析方法验证

第一节、定量分析方法的特点一、容量分析法

是将已知浓度的滴定液由滴定管滴加到待测药物的溶液中，直到所加滴定液与被测药物按化学计量反应完全为止，然后根据滴定液的浓度和消耗的体积，就可计算出被测药物的含量。滴定终点与等当点不符---滴定误差，需要选择合适的指示剂指示终点。(一)容量分析法的特点

1、快速，准确，灵敏度高

2、适合于高含量或中含量组分分析

3、仪器简单，操作方便适用范围广

(二)容量分析法的计算问题滴定度：指每1ml某摩尔的滴定液所相当的被测药物重量。Chp用mg来表示。aA＋bB→cC＋dDT(mg/ml)=m×-×M其中，m为滴定液的摩尔浓度，a为被测药物的摩尔数，b为滴定液的摩尔数，M为被测药物的毫摩尔质量（分子量）。ba直接滴定法：以滴定液的浓度和体积直接计算含量。W含量（%）=×100%V×T×F百分含量计算其中，V是消耗滴定液体积；T为标准滴定度（药典规定）；F为相对浓度（实际浓度和标准浓度比值），校正因数，

W为供试品取样量。

例题称取对氨基水杨酸钠0.4132g，按药典规定加水和盐酸后，按永停滴定法用亚硝酸钠滴定液（0.1023mol/L）滴定到终点，消耗亚硝酸钠滴定液22.91ml，求对氨基水杨酸钠（C7H6NO3Na）的百分含量？分子量175。生成物滴定法计算时考虑被测物和生成物以及滴定剂三者之间的化学计量关系。剩余滴定法：此法是先加入定量过量的滴定液A，使其与被测药物反应；待此反应进行完全后，再用另一滴定液B来回滴反应中剩余的滴定液A1）无空白实验含量%=

2）空白实验含量%=例题取标示量为0.5g阿司匹林10片，称出总重为5.7680g，研细后，精密称取0.3576g，按药典规定用两次加碱剩余碱量法测定。消耗硫酸滴定液（0.05020mol/L）22.92ml，空白试验消耗该硫酸滴定液39.84ml，求阿司匹林的含量为标示量的多少？

（T=18.08mg/ml，药典硫酸标准溶液为0.05mol/L，阿司匹林的分子量180.16）（一）紫外-可见分光光度法

1.特点:

1）灵敏度高，可达10-4g/ml一10-7g/ml

2）准确度高，相对误差为2%一5％。

3）仪器价格较低廉，操作简单，易于普及。

4）应用广泛。二、光谱分析法2.朗伯一比耳定律：

A=ElC

式中A一吸收度l一液层厚度；C一溶液浓度；E一吸收系数，即单位浓度、单位液层厚度时的吸收度。

3.仪器校正和检定

4.对溶剂的要求测定供试品之前，应先检查所用的溶剂在供试品所用的波长附近是否符合要求。

5.测定法测定时，须作波长校正。并作空白吸收。

（1）对照品比较法：分别配制供试品溶液和对照品溶液，在规定的波长测定供试品溶液和对照品溶液的吸收度后，计算供试品中被测溶液的浓度：式中Cx为供试品溶液的浓度,Ax为供试品溶液的吸收度，Cr为对照品溶液的浓度,Ar为对照品溶液的吸收度，D为稀释倍数，W为供试品取样量。含量测定的方法（2）吸收系数法：配制供试品溶液，在规定的波长处测定其吸收度，再以该品种在规定条件下的吸收系数计算含量。

用本法测定时，应注意仪器的校正和检定。（3）计算分光光度法（4）比色法例题

对乙酰氨基酚的含量测定：取本品42mg，精密称定，置250ml量瓶中，加0.4%氢氧化钠溶液50ml溶解后，加水至刻度，摇匀，精密量取5ml，置100ml量瓶中，加0.4%氢氧化钠溶液10ml，加水至刻度，摇匀，照分光光度法，在257nm的波长处测定吸收度为0.572。按C8H9NO2的吸收系数为715计算。求对乙酰氨基酚的百分含量？本法特点为：

（1）灵敏度高，其灵敏度可达10-10g/ml一10-12g/ml

（2）荧光分析法应在低浓度溶液中进行

（3）空白试验

（4）荧光衍生化试剂

（5）取样少，方法快速(二)荧光分析法2.含量测定

在每次测定前，用一定浓度的对照品溶液校正仪器的灵敏度；然后在相同条件下，读取对照品溶液及其试剂空白的荧光读数与供试品溶液及其试剂空白的荧光读数，用下式计算供试品浓度：应在0.50-2.0之间三、色谱分析法(一)HPLC法：要求RSD<2％，回收率98％～102％之间。线性范围：专属性：要考查辅料、有关物质或降解产物对主药的色谱峰是否有干扰，如有干扰应设法排除。1.仪器为高效液相色谱仪。

色谱柱的填充剂和流动相的组分应按各品种项下规定。

注样量一般为数微升。

柱温一般为室温，检测器为紫外吸收检测器。

正文中各品种项下规定的条件除固定相种类、流动相组分、检测器类型不得任意改变外、其余如色谱柱内径、长度、固定相牌号、载体粒度、流动相流速、混合流动相、各组分的比例、柱温、进样量、检测器的灵敏度等，均可适当改变，以适应具体品种并达到系统适用性试验的要求。一般色谱图20分钟内记录完毕。2.系统适用性试验

色谱柱的最小理论板数、分离度、重复性和拖尾因子。

3.测定法

定量测定时，可根据供试品的具体情况采用峰面积法或峰高法。测定供试品中主成分含量时，常用两种方法：

(1)内标法加校正因子：精密称取药物对照品和内标物质，配成校正因子测定用的药物对照溶液。测量对照品和内标物质的峰面积或峰高，按下式计算校正因子：再取各品种项下含有内标物质的供试品溶液，注入仪器，记录色谱图，测量供试品中待测成分和内标物质的峰面积或峰高，按下式计算含量：（2）外标法

外标法是以供试品的对照品或标准品作对照物质，相比较以求得供试品的含量，要求进样量准确及操作条件稳定。

外标法可分为标准曲线法和外标一点法。1）标准曲线法：

作出峰面积（或峰高）与浓度的标准曲线。测得待测组分的峰面积（或峰高），根据回归方程，计算供试品中待测组分的浓度。2）外标一点法：

按下式计算含量：（二）气相色谱法

流动相为气体，称为载气

色谱柱分为填充柱和毛细管柱两种

进样口的供试品被加热气化

检测器1.系统适用性试验

同高效液相色谱法项下规定。

2.测定法

同高效液相色谱法项下规定。

气相色谱法进行定量分析时，尽可能采用内标法为宜。

第二节样品分析的前处理方法一.概述

含金属或卤素的药物，在分析前需要经过不同方法处理后，方可进行测定。

含氮、硫、磷元素的有机药物

含金属的有机药物：

一是金属原子不直接与碳原子相连，常为有机酸及酚的金属盐或配位化合物，其分子结构中的金属原子结合不够牢固

二是金属原子直接与碳原子以共价键相连接，结合状态比较牢，称为有机金属药物。酒石酸锑钾醋酸苯汞卡巴胂硬脂酸镁富马酸亚铁葡萄糖酸锑钠汞撒利含卤素有机药物系指药物分子结构中所含卤素直接与芳环或脂肪链相连者结构特点：C—X（一）卤原子的活泼性1.卤原子与碳原子直接相连，卤原子的活泼性和它直接相连的烃基的结构有很大关系（1）乙烯型卤和芳卤不活泼泛影酸诺氟沙星磺溴酞钠（2）烯丙型卤和苄卤活泼（3）卤代烷型介于两者之间2.分子中所含卤原子的个数分子中所含卤原子的个数越多，活泼性越强，特别是同一碳上含多个卤原子或一个苯环上含多个卤原子时，活泼性增强更加明显。二、不经有机破坏的分析方法（一）直接测定法凡金属原子不直接与碳原子相连的含金属药物或某些C－M键结合不牢固的有机金属药物，在水溶液中可以电离，因而不需有机破坏，可直接选用适当的方法进行测定。

(1)含锑药物(2)含铁药物在酸性溶液中可游离出具有氧化性的Sb5+

、Fe3+氧化碘化钾析出碘，用硫代硫酸钠滴定。（间接碘量法）。1配位滴定法2氧化还原滴定法

例葡萄糖酸锑钠的测定ChP

取本品约0.3g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加水100ml、盐酸15ml与碘化钾试液10ml，密塞、振摇后，在暗处静置10min，用硫代硫酸钠滴定液(0.1mol/L)滴定，至近终点时，加淀粉指示液，继续滴定至蓝色消失，并将滴定的结果用空白试验校正。每lml的硫代硫酸钠滴定液(0.1mol/L)相当于6.088mg的Sb。

富马酸亚铁的含量测定ChP取本品约0.3g，精密称定，加稀硫酸

15ml，加热溶解后，放冷，加新沸过的冷水50ml与邻二氮菲指示液2滴，立即用硫酸铈滴定液(0.1mol/L)滴定，并将滴定的结果用空白试验校正。每1ml硫酸铈滴定液(0.1mol/L)相当于16.99mg原理Fe2++Ce4+Ce3++Fe3+

Fe2++e-Fe3+红色浅蓝色OOCCHOHCCOˉˉ+Fe2+（二）经水解后测定法

1.碱水解后测定法本法是将含卤素有机药物溶于适当溶剂（如乙醇）中，加入氢氧化钠溶液（或一定量过量的硝酸银滴定液）后，加热回流使其水解，将有机结合的卤素转变为无机的卤素离子，然后采用银量法测定。

本法适用于含卤素有机药物结构中卤素原子结合不牢固的药物（如卤原子和脂肪碳原子相连者）。

原理

三氯叔丁醇在氢氧化钠溶液中加热回流水解，氯元素全部转变成氯化钠，然后用剩余滴定法，即于水解液中加硝酸酸化，再加入定量过量的硝酸银滴定液，使Cl-生成AgCl沉淀，过量的硝酸银，以Fe3+为指示剂，用硫氰酸铵液回滴定。例:三氯叔丁醇的测定ChP（2000）CCl3-C(CH3)2-OH+4NaOH

△回流(CH3)2-CO+3NaCl+HCOONa+2H2ONaCl

+AgNO3

AgCl↓

+NaNO3

AgNO3+

NH4SCNAgSCN↓+

NH4NO3（淡棕红色）(Ksp=1.56×10–10)(Ksp=1.0×10-12)Fe3++SCNˉFe(SCN)2+

2.用硫酸水解后测定法例

硬脂酸镁的测定

取本品约0.1g，精密称定，精密加硫酸滴定液(0.05mol/L)50ml，煮沸至油滴澄清，继续加热10min，放冷至室温，加甲基橙指示液1~2滴，用氢氧化钠滴定液(0.1mol/L)滴定。每1ml硫酸滴定液(0.05mol/L)相当于2.016mg的MgO。原理：Mg(C17H35COO)2+H2SO4

△MgSO4

+2C17H35COOH2NaOH+H2SO4

Na2SO4+2H2O例汞撒利的测定

取本品约0.5g，精密称定，加蒸馏水10ml，置冰浴中，滴加硫酸10ml，随滴随搅拌，至产生的沉淀复溶解，再加蒸馏水50ml，硫酸铁铵指示液2ml，用硫氰酸铵滴定液(0.1mol/L)滴定。每1ml硫氰酸铵滴定液(0.1mol/L)相当于25.29mg的汞撒利。

本法适用于测定结构中碘与苯环直接相连，且一个苯环上含多个碘原子的含卤素有机药物。

碱性溶液中加还原剂回流碳一碘键断裂形成无机碘化物后测定(三)经氧化还原后测定法1.碱性还原后测定（如锌粉）例泛影酸的测定取本品约0.4g，精密称定，加氢氧化钠溶液30ml与锌粉1.0g，加热回流30min，放冷，冷凝管用少量水洗涤，滤过，烧瓶与滤器用水洗涤3次，每次15ml，洗液与滤液合并，加冰醋酸5ml与曙红钠指示液5滴，用硝酸银滴定液(0.1mol/L)滴定。每1ml硝酸银滴定液(0.1mol/L)相当于20.46mg的C11H9I3N2O4。COOHINHCOCH3IIH3COCHN+11NaOH+Zn回流△COONaNH2

H2N+3NaI+2CH3COONa+2Na2ZnO2+H2O

ChP收载的胆影酸、碘番酸、胆影葡胺、泛影葡胺、碘他拉酸等均采用同法测定。醋酸酸性条件→锌粉还原→碳一碘键断裂→形成无机碘化物

2.酸性还原后测定法取本品的干燥品约0.4g，精密称定，加锌粉1g及冰醋酸10ml，加热回流30min，放冷，冷凝管用水30ml洗涤，用脱脂棉过滤，烧瓶与脱脂棉用水洗涤2次，每次20ml，洗液与滤液合并，加四溴酚酞乙酯指示液1ml，用硝酸银滴定液(0.1mol/L)滴定。终点时黄色沉淀变为绿色。每1ml硝酸银滴定液(0.1mol/L)相当于19.031mg的C11H12I3NO2。例碘番酸的测定三、经有机破坏的分析方法

适用于金属、卤素、氮、硫等与碳原子结合牢固的有机药物。(一)

湿法破坏本法适用于血、尿、组织等生物样品的破坏，有机金属药物破坏，氮、硫、磷测定法的前处理。1.硫酸-高氯酸法2.硫酸-硝酸法3.硫酸-硫酸盐法硫酸-硫酸盐法用于含砷或锑有机药物的破坏，破坏得到的无机金属离子多为低价态。含氮有机药物凯氏定氮法1.原理2.仪器装置3.消解剂注意事项：

1.湿法破坏所用的仪器，一般为硅玻璃或硼玻璃制成的凯氏烧瓶；

2.所用试剂及蒸馏水均不应含有被测金属离子或干扰测定的其他金属离子等组分；

3.由于整个操作过程所用矿酸量数倍于样品，所以必须按相同条件进行空白试验校正；

4.操作时应在通风橱内进行。(二)干法破坏

适用于湿法不易破坏完全的有机物以及某些不能用硫酸进行破坏的有机药物。将适量样品置于坩埚中，混合均匀后，先小火加热，使样品完全炭化，然后放入高温炉中灼烧，使其灰化完全，即可。1高温炽灼法常加无水碳酸钠或氧化镁等以助灰化Ca(OH)2法(含砷样)

称5g样+5gCa(OH)2→于蒸发皿→加少量水→均匀→保温炭化→500℃马福炉→灰白色→冷却→加6NHCL溶解→定容50ml2氧瓶燃烧法

（1）原理

将有机药物放入充满氧气的密闭燃烧瓶中进行燃烧，并将燃烧所产生的欲测物质吸收于适当的吸收液中，然后根据欲测物质的性质，采用适宜的分析方法进行鉴别、检查或含量测定。

适用于含卤素、硫、氮、硒等有机药物的分析本法特点是简便、快速、破坏完全，尤其适用于微量样品的分析（2）仪器与材料

①仪器装置燃烧瓶为500、1000或2000ml无色、磨口、厚壁、硬质玻璃锥型瓶；瓶塞空心，底部熔封铂丝一根，下端呈螺旋状或网状②称样用材料及称样

A.固体样品无灰滤纸

B.液体样品纸袋

C.软膏类样品：将样品置蜡油纸中包裹严密，外层再用无灰滤纸包裹氧瓶燃烧法装置与样品包装操作图④吸收液

A.作用③氧气B.吸收液的选择氟水

氯NaOH溶液溴H2O-NaOH,SO2碘H2O-NaOH硫浓H2O2

硒硝酸溶液（3）操作方法①燃烧瓶燃烧前的准备洗净后，加入吸收液，瓶口湿润，通入氧气1min，用表面皿覆盖瓶口。②样品的准备取样品，精密称定，包裹，固定于铂丝下端的网内或螺旋处。③样品的燃烧点燃包有供试品的滤纸尾部，迅速放入燃烧瓶中，按紧瓶塞，加水少量封闭瓶口，燃烧完毕（应无黑色碎片），充分振摇，使生成的烟雾完全吸入吸收液中，放置15min，用水少量冲洗瓶塞及铂丝，合并洗液及吸收液，同法另做空白试验。然后按各药品项下规定的方法进行鉴别、检查或含量测定。①根据被燃烧分解的样品量选用适宜大小的燃烧瓶。（4）注意事项

②测定含氟有机药物时，用石英制燃烧瓶③铂丝燃烧时起催化作用④应同时做空白试验⑤燃烧时要注意防爆⑥燃烧要完全⑦燃烧产生的烟雾完全被吸收例碘苯酯的含量测定原理碘苯酯系有机碘化物，用氧瓶燃烧分解，转变为碘化物，继而氧化为游离的碘，并被定量地吸收于吸收液中，和氢氧化钠反应，生成碘化物与碘酸盐，加入溴-醋酸溶液，使全部转变为碘酸盐，过量的溴以甲酸及通空气去除。加入碘化钾，使与碘酸盐反应析出游离碘，用硫代硫酸钠液滴定，碘与淀粉结合所显的蓝色消失即为终点。（5）应用

取本品约20mg，精密称定，照氧瓶燃烧法进行有机破坏，用氢氧化钠试液2ml与水l0ml为吸收液，待吸收完全后，加溴醋酸溶液(取醋酸钾10g，加冰醋酸适量使溶解，加溴0.4ml，再加冰醋酸使成1000m1)l0ml，密塞，振摇，放置数分钟，加甲酸约lml，用水洗涤瓶口，并通入空气流约3～5min以除去剩余的溴蒸气，加碘化钾2g，密塞，摇匀，用硫代硫酸钠滴定液(0.02Mol/L)滴定，至近终点时，加淀粉指示液，继续滴定至蓝色消失，并将滴定的结果用空白试验校正。每lml的硫代硫酸钠滴定液(0.02mol/L)相当于1.388mg的C19H29IO2。例碘苯酯的含量测定（5）应用1.氧瓶燃烧法中的装置有A.磨口硬质玻璃锥形瓶B.磨口软质玻璃锥形瓶C.铂丝D.铁丝E.铝丝2.选择氧瓶燃烧法所必备的实验物品A.磨口硬质玻璃锥形瓶B.铂丝C.普通滤纸D.氢气

E.无灰滤纸3．氧瓶燃烧法测定含氯有机药物时所用的吸收液多数为A.H2O2溶液B.H2O2—NaOH溶液C.NaOH溶液D．硫酸肼饱和液E.NaOH—硫酸肼饱和液4.氧瓶燃烧法可用于A.含卤素有机药物的含量测定B.醚类药物的含量测定C.检查甾体激素类药物中的氟D.检查甾体激素类药物中的硒E.芳酸类药物的含量测定第三节药品质量标准分析方法验证一)目的

证明所采用的分析方法适合于相应的检测要求，方法验证过程和结果均应记载在药品标准起草和修订说明中。

二)用途（一）药品质量标准起草时，分析方法需经验证。（二）药物合成方法变更、制剂的组分变更、原分析方法进行修订时，分析方法需经验证。三)需验证的分析项目1.鉴别试验；2.杂质定量或限度检查；3.原料或制剂中有效成分含量测定；4.制剂中其它成分（降解产物、防腐剂等）的测定；5.溶出度、释放度等功能检查中的溶出量等的测试方法。验证内容有：准确度、精密度（重复性、中间精密度和重现性）、专属性、检测限、定量限、线性、范围和耐用性。四)验证内容

一、

准确度（accuracy）

准确度是指用该方法测定的结果与真实值或参考值接近的程度，用百分回收率表示。

测定回收率R（recovery）的具体方法可采用“回收试验法”和“加样回收试验法”。

回收试验

空白+已知量的对照品（或供试品）测定。原料药可用已知纯度的对照品或样品进行测定，或用本法所得结果与已建立准确度的另一方法测定的结果进行比较。

加样回收试验

已准确测定药物含量的真实样品+已知量的对照品（或标准品）测定。

制剂可用含己知量被测物的各组分混合物进行测定，即采用在空白辅料中加入原料药对照品的方法。如不能得到制剂的全部组分，可向制剂中加入已知量的被测物进行测定，或与另一个已建立准确度的方法比较结果。

数据要求规定的范围内，至少用9次测定结果评价，如制备三个不同浓度样品各测三次。

中药分析的准确度一般用加样回收试验衡量。中药回收率一般要求在95～105%范围内，有些方法操作步骤繁多时，可要求在90～110%范围内。RSD一般在3%以内。二、精密度（precision）

是指在规定条件下，同一个均匀样品，经多次取样测定所得结果之间的接近程度。用偏差（d）、标准偏差(SD)、相对标准偏差(RSD)（变异系数，CV）表示。偏差（d）：测量值与平均值之差标准（偏）差（SD或S）相对标准（偏）差（RSD），也称变异系数（CV）

1.重复性在相同条件下，由同一个分析人员测定所得结果的精密度；在规定的范围内，至少用9次测定结果评价，如制备三个不同浓度样品各测三次或把被测物浓度当作100%，至少测6次进行评价。

2.中间精密度同一实验室，不同时间由不同分析人员用不同设备所得结果的精密度。考察随机变动因素的影响