AbMoleTGS1 与人类端粒酶 RNA：探索端粒维持的关键机制

AbMole|TGS1与人类端粒酶RNA：探索端粒维持的关键机制端粒酶在维持端粒长度和稳定性方面起着关键作用，而TGS1介导的人类端粒酶RNA（hTR）的2,2,7-三甲基鸟苷（TMG）加帽结构对于将端粒酶招募到端粒以及参与Cajal体（CBs）在端粒维持中的作用至关重要。来自DipartimentodiScienzedellaVita，UniversitàdegliStudidiTrieste的ValentinaBuemi,OdessaSchillaci,MariangelaSantorsola等多名研究人员发表了题为《TGS1mediates2,2,7-trimethylguanosinecappingofthehumantelomeraseRNAtodirecttelomerasedependenttelomeremaintenance》的研究成果。在该文章中，研究人员使用了购自AbMole的TC-S7001（目录号M7388）。文章探讨TGS1在端粒维持中的作用及其机制。通过酶抑制或瞬时siRNA介导的敲低，在H1299肺癌细胞和肺腺癌衍生的肿瘤类器官中消除TGS1功能。结果显示，TGS1敲低导致H1299细胞中hTR的2,2,7-TMG加帽减少5倍，而天然核苷sinefungin处理H1299细胞10天，可使TGS1蛋白水平逐渐降低，hTR的2,2,7-TMG加帽显著减少4倍，同时不影响TRF2和肌动蛋白等mRNA的加帽。在独立的肺癌模型中，从手术切除的人肺腺癌生成的肿瘤类器官实验也得到了相似的结果，即sinefungin处理导致TGS1蛋白减少，但mRNA不变。图1：临床前肺癌模型中TGS1阻断2,2,7-TMG加帽的抑制作用。sinefungin处理或TGS1敲低的H1299细胞及肿瘤类器官中，CB数量显著减少，端粒与剩余CB的关联也显著降低，表明TGS1缺失会损害基于CB的端粒维持途径。通过TRAP实验发现，H1299细胞中瞬时RNAi介导的TGS1耗尽或sinefungin处理后，体外端粒酶活性显著增加，同时hTR表达略有增加，但hTERT、TRF2或TRF1的表达在蛋白质或mRNA水平上不受影响。在稳定过表达hTERT的H1299细胞克隆（clone-9）和同时过表达FLAG-hTERT和hTR的H1299细胞克隆（clone-22）中，TGS1瞬时敲低显著减少了FLAG-hTERT与端粒的共定位频率，hTRRNA-FISH结合抗TRF2免疫荧光显示TGS1敲低细胞中端粒酶RNA组分向染色体末端的募集显著减少，sinefungin处理的clone-22细胞中FLAG-hTERT向端粒的募集也受到抑制。图2：TGS1指导涉及Cajal体的端粒酶依赖性端粒维持。对H1299细胞和肺肿瘤类器官进行定量DNA-FISH（Q-FISH）分析显示，TGS1敲低或sinefungin处理10天后，G丰富的端粒链长度增加10%和15%，而C丰富的端粒链长度分别减少38%和42%，恢复TGS1功能后，端粒长度变化恢复正常。在H1299细胞模型中，急性RNAi介导的hTERT耗尽也会导致G丰富和C丰富端粒链长度的改变，与sinefungin处理或TGS1耗尽的H1299细胞相似。TGS1敲低和sinefungin处理均导致H1299细胞和肺肿瘤类器官中PML体数量增加，PML体与端粒的共定位频率增加，提示TGS1功能丧失促进了APB的形成，这是ALT细胞的关键特征。TGS1缺失导致的端粒姐妹染色单体交换（T-SCE）率显著增加，而siRNA介导的RAD51耗尽可将TGS1敲低的H1299细胞中增加的T-SCE频率恢复到对照水平。TGS1抑制端粒酶阳性癌细胞中的ALTsiRNA介导的TGS1耗尽导致端粒处的DNA:RNA杂合体水平增加，磷酸化ATR（Ser428）在端粒的定位增加，RAD51募集到端粒，RAD51在PML体中的定位增加，BLM焦点与端粒标记TRF1的共定位频率增加，C-环形成增加。图3：TGS1抑制端粒酶阳性癌细胞中的ALT。在H1299细胞中，TGS1缺失导致G丰富的端粒链增加，C丰富的端粒链长度减少，而同时缺失TGS1和EXO1时，这种端粒长度变化得到恢复。EXO1缺失还挽救了TGS1敲低的H1299细胞中CB体数量和CB与端粒的共定位频率，消除了端粒向PML体的增加定位。进一步实验发现，sinefungin和5-Aza-2′-脱氧胞苷联合处理增加了sinefungin处理的H1299细胞中的APB数量，增强了BLM螺旋酶向端粒的募集和C-环形成，使C丰富的端粒链长度增加53%，G丰富的端粒链长度增加40%，同时提高了DNA聚合酶δ亚基POLD3向端粒的募集，提示ALT介导的端粒延伸。本研究表明，TGS1介导的hTR的2,2,7-TMG加帽在将端粒酶复合物引导至染色体末端以及使CB参与端粒维持方面起着关键作用。TGS1缺失或被sinefungin抑制会阻断端粒酶向端粒的招募，导致EXO1介导的单链3'端粒突出的形成，进而参与RAD51依赖性同源重组和APB形成。端粒酶阳性的H1299细胞和肺肿瘤类器官中TGS1敲低细胞的端粒单链改变与端粒酶阴性ALT细胞中的经典端粒特征相关，如DNA:RNA杂合体负载增加、复制应激、RAD51和BLM募集到端粒重复序列、APB形成、端粒姐妹染色单体交换率升高以及C-环丰度增加等。总之，TGS1依赖的hTR的2,2,7-