TBWDP 0002-2022 北京市酒庄葡萄酒赭曲霉毒素A 限量及检测方法

ICS67.160.10CCSX62T/BWDP0002-2022LimitanddeterminationofOchra2022-10-28发布北京酒庄葡萄酒发展促进会发布1本文件参考GB5009.96-2016，主要变化如下：——简化了葡萄酒样品的前处理方法（无需经过免疫亲和柱净化——提高了葡萄酒中赭曲霉毒素A的检测灵敏度（检出限和定量限从1.0μg/kg和3.0μg/kg提高到0.02μg/kg和0.05μg/kg——缩短了检测时间（从15min缩短为6min）。本文件所规定附录为资料性附录。本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本标准由北京酒庄葡萄酒发展促进会提出并归口。本文件起草单位：中国农业大学、北京酒庄葡萄酒发展促进会、北京龙熙堡葡萄酒业有限公司、北京紫雾采邑酒业有限公司、北京京沃德酒庄有限公司、北京莱恩堡葡萄酒业有限公司。本文件主要起草人：游义琳、战吉宬、黄卫东、伍天阳、谢一丁、周慧、李礼、刘雪玮、郝越、王明⻜。本标准于2022年10月28日首次发布。1北京市酒庄葡萄酒赭曲霉毒素A限量及检测方法本文件规定了北京市酒庄葡萄酒中赭曲霉毒素A的限量要求和测定方法。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB2761食品安全国家标准食品中真菌毒素限量GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB5009.96食品安全国家标准食品中赭曲霉毒素A的测定3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1赭曲霉毒素A（OchratoxinA）赭曲霉毒素A是一种由曲霉属和青霉属霉菌产生的次级代谢产物，化学式为C20H18ClNO6，CAS号：303-47-9，具有肾毒性和致癌性，在2017年被世界卫生组织国际癌症研究机构划分为2B类致癌物，能在葡萄酒中积累。4原理试样用提取液提取，离心净化，经反相色谱分离，测定赭曲霉毒素A的含量（液相色谱串联质谱法测定外标法定量。5试剂和材料除非另有说明，所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水。5.1.1乙腈（CH3CNCAS号：75-05-8，色谱纯。5.1.2甲醇（CH3OHCAS号：67-56-1，色谱纯。5.1.3甲酸（HCOOHCAS号：64-18-6，色谱纯。5.2试剂配制5.2.1提取液：甲醇:水（v/v=2:3）。5.3标准品2赭曲霉毒素A（C20H18ClNO6，CAS号：303-47-9纯度≥99%。或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。5.4标准溶液配制5.4.1赭曲霉毒素A标准储备液10μg/m）L：准确称取一定量的赭曲霉毒素A20mg（精确至0.1mg）于10mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，配制成10μg/mL的标准储备液，于-20℃避光保存，有效期3个月。5.4.2赭曲霉毒素A标准工作液：量取的赭曲霉毒素A标准储备液（5.4.1用提取液进行稀释，分别配成含有赭曲霉毒素A0.1ng/mL、0.5ng/mL、1.0ng/mL、2.5ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、50ng/mL的标准工作溶液，标准工作溶液现用现配。6仪器和设备液相色谱-串联质谱仪：配有电喷雾电离源。6.2分析天平：感量0.01g和0.0001g。6.3离心机：转速不低于6000rpm。6.4超声波清洗仪：功率不低于200w。7分析步骤7.1试样制备与提取取脱气酒类试样(含二氧化碳的酒类样品使用前先置于4℃冰箱冷藏30min,过滤或超声50kHz5min脱气)或取其他不含二氧化碳的酒类试样5mL于离心管中，5000rpm离心3min，去除酒中杂质。吸取上清液100μL（精确至1μL加入900μL提取液（2.2.1混匀，过0.22μm聚四氟乙烯滤膜于液相小瓶中，待上机检测。7.2仪器参考条件7.2.1高效液相色谱参考条件列出如下：a)色谱柱：C18柱，柱长100mm，内径2.1mm，粒径1.7μm，或等效柱；b)柱温：40℃;c)进样量：5μL；d)流速：0.3mL/min；e)流动相A液：0.2%的甲酸水溶液，量取1mL色谱级甲酸溶解于500mL水中，混3匀，脱气，备用；f)流动相B液：0.2%的甲酸乙腈溶液，量取1mL色谱级甲酸溶解于500mL色谱级乙腈中，混匀，脱气，备用。g)检测过程中对流动相A液与流动相B液比例进行梯度设定（具体设定内容见表1）。表1流动相及梯度洗脱条件007.2.2质谱参考条件质谱参考条件列出如下：a)离子化方式：电喷雾电离（ESIb)毛细管电压：3.2kV；c)离子源温度：150℃;d)脱溶剂温度：500℃;e)脱溶剂气为高纯氮气，流速1000L/h；碰撞气为高纯氩气，流速150L/h；f)扫描方式：正离子扫描；g)检测方式：多反应监测，参数详见表2；h)上述操作参数是典型的，可根据不同仪器特点，对给定的操作参数作适当调整，以期获得最佳效果。典型的赭曲霉毒素A标准品高效液相色谱四极杆质谱联用选择离子流图见图1。4T/BWDP0002-20母离子/子离子(m/z)83.504.004.50图1赭曲霉毒素A标准物质的多反应监测(MRM)色谱图7.3.1试样中赭曲霉毒素A子离子图的保留时间与相应标准子离子图保留时间相比较，变化丰度比与浓度相当的标准溶液比，其允许偏差不超过表3规定的范围。允许相对偏差7.3.2目标化合物以保留时间和两对离子(特征离子对/定量离子对)所对应的色谱峰面积相7.3.4在5.2的仪器条件下，将赭曲霉毒素A标准工作溶液按浓度从低到高依次注入高效液相色谱-串联质谱仪；待仪器条件稳定后，以目标物质的浓度为横坐标(x轴),目标物质的峰面积为纵坐标(y轴),对各个数据点进行最小二乘线性拟合，标准工作曲线按式(1)计5y———目标物质的峰面积；a———回归曲线的斜率；x———目标物质的浓度；b———回归曲线的截距。8分析结果和表述试样中赭曲霉毒素A的含量按式（2）计算：X×f（2）式中：X———试样中赭曲霉毒素A的含量，单位为微克每千克(μg/kgρ———待测试样液中赭曲霉毒素A的含量，单位为纳克每毫升（ng/mLV———标准工作液测定体积，单位为微升(μL1000——单位换算常数m———试样的质量，单位为毫克（mgf———稀释倍数