机能实验设计书

【研究题目】钙通道阻滞药（CCBs）与非甾体类抗炎药（NSAIDs）联合应用治疗痛风（gout）急性发作的优势【研究目的】制备高尿酸血症与低温诱发的大鼠急性痛风性关节炎模型验证文献报导的钙通道阻滞药对痛风的治疗效果，观察非甾体类抗炎药治疗急性痛风性关节炎的疗效与其不良反应观察两药联合应用时是否可以减少NSAIDs的不良反应并增加疗效【理论依据及研究现状】一、痛风(gout)是由于嘌呤代谢紊乱，尿酸产生过多及(或)尿酸排泄减少，在体内析出结晶、蓄积沉积所致的一组代谢性疾病。临床主要表现为高尿酸血症、急性痛风性关节炎反复发作、痛风石等，严重者可致关节畸形及肾损害。急性痛风性关节炎是成年男性最常见的炎症性关节炎，也是痛风患者就医的最主要原因。急性发作时，尿酸钠(MSU)微晶体沉积于关节而引起局部粒细胞浸润及炎症反应，如未及时治疗可发展为慢性痛风性关节炎或肾病变。随着我国生活水平的提高，人们摄入高嘌呤食物日益增多，痛风的发病率呈现逐年递增的趋势【1】，据NHIS研究结果显示，亚洲以我国台湾地区痛风患病率居高，达11.7%【2】。此外，痛风与高血压、高脂血症等疾病的发生也有密切相关性【3】，已成为严重威胁人类健康的一种代谢性疾病。二、目前临床上有许多防治痛风的药物,但由于部分药物适应症限制及不良反应较多,患者常因不能忍受而停止治疗，导致痛风仍不能得到很好的控制【4】，例如：别嘌呤醇(Allopurinol)可有效抑制尿酸生成，但由于严重毒性而不适用于肾功能损伤、排泄不足的病人【5】；丙磺舒(probenecid)、苯溴马隆(Benzbromaron)等可促进尿酸排泄，但易引起尿酸盐结晶的尿路沉积而致肾损害【6】；尿酸酶类药物价格昂贵【7】；秋水仙碱（Colchicine）可抑制白细胞进入关节、减少急性痛风局部粒细胞浸润，但由于治疗剂量与中毒剂量十分接近，胃肠道反应、肝细胞坏死等不良反应多见【8】；非甾体类抗炎药（NSAIDs）是治疗急性痛风的首选药物。炎症反应时损伤因子可使前列腺素（PG）合成增加，导致血管扩张、组织水肿，并与缓激肽等协同产生致炎作用。吲哚美辛、萘普生、舒林酸等NSAIDs通过抑制环氧化酶（COX）活性、减少PG合成而发挥抗炎、缩血管作用。但NSAIDs治疗关节炎时，由于需要长期大量给药，不良反应的发生率很高【9】，常导致：胃粘膜血流减少、胃粘液分泌减少、胃酸增多，进而引起消化性溃疡和胃肠道出血穿孔，最为常见；肾血流量减少，长期使用可导致慢性肾炎和肾乳头坏死；心律不齐、血压升高、心悸等心血管不良反应；选择性COX-2抑制药的胃肠道反应较轻，但其心血管不良反应仍显著。三、随着治疗经验的积累，和对各种药物的局限性及不良反应的深入了解,寻找疗效更佳、不良反应更小的新药或新的治疗方法一直是痛风治疗研究的热点。近年来国外研究发现【10】，长效钙通道阻滞药(CCBs)如硝苯地平和西尼地平，除了能够扩张外周血管治疗高血压，还能减少高血压等原因引起的骨骼肌低氧环境下肌细胞中尿酸前体物质的生成，具有降低血浆尿酸浓度的作用，故可以用来治疗痛风。高血压既是痛风最常见的合并症之一，也是痛风发生的独立风险因素，因此长效CCBs对伴有高血压的痛风的治疗作用颇具应用价值，并且CCBs还具有相对安全、不良反应较轻的优点。受该结果启发，本实验将CCBs的药理作用与NSAIDs的不良反应进行比对，还发现CCBs具有减少NSAIDs诸多不良反应的潜在可能性：①据文献报导【11】，CCBs可舒张胃粘膜血管、增加胃粘膜血流量，并降低胃壁肌张力和收缩力、抑制胃酸分泌，或可对抗NSAIDs引起的消化性溃疡。②CCBs的舒血管作用可增加肾血流量，对肾脏具有保护作用【12】，或可减轻NSAIDs引起的肾脏损害③CCBs作为常用的抗高血压药和抗心律失常药，可对抗NSAIDs引起的血压升高、心悸等不良反应。此外，据报道CCBs与NSAIDs合用还可使硝苯地平、维拉帕米的血药浓度升高。但是二者合用也可能会导致胃肠道出血加重。因此，若本实验证实两药合用时不会影响各自的疗效，且CCBs能够确实减少NSAIDs引起的消化性溃疡等不良反应，同时不引起新的不良反应，将有可能为急性痛风性关节炎的治疗提供一个新的可能。四、目前常用的痛风模型主要有两大类，一为单纯的高尿酸血症模型，二为关节腔注射尿酸盐诱发的急性痛风性关节炎模型，但两种模型都只涉及人类痛风发病机制的一部分。本实验采用了今年3月报导的次黄嘌呤重复灌胃加冰敷法诱导的大鼠急性痛风性关节炎模型【13】，该模型能较好的模拟高尿酸血症人类在低温环境下诱发痛风性关节炎的机制，且为本实验同时研究CCBs降低血尿酸的作用与NSAIDs治疗关节炎的作用提供了方便。【研究内容】制备高尿酸血症和低温诱发的的大鼠急性痛风性关节炎模型，以西尼地平为例验证CCBs降低血尿酸的作用，以吲哚美辛为例观察NSAIDs对急性痛风性关节炎的疗效及其不良反应，并观察两药联合应用时是否可以减少NSAIDs的不良反应并增加疗效。【研究方法】实验对象：60只12周龄SD大鼠，雄性，体重（200±20）g器材及药品：鼠笼、电子分析天平、灌胃针、模板、纱布、气球、冰块、次黄嘌呤、西尼地平、吲哚美辛、游标卡尺、尿酸试剂盒、大鼠手术器材等实验组与对照组的处理：60只大鼠适应性喂养1周后随机分为5组，每组12只，分别为空白对照组、模型对照组、西尼地平治疗组、吲哚美辛治疗组和联合用药组。除空白对照组外，均制备成急性痛风性关节炎模型。西尼地平治疗组给予西尼地平，吲哚美辛治疗组给予吲哚美辛，联合用药组合用两药，空白对照组、模型对照组给予等量生理盐水。观察指标：测量大鼠右下肢最大直径变化，观察大鼠步态并进行评分【14】，麻醉后眼球取血测量血尿酸浓度，并取关节滑膜做病理检查【15】，用以评估动物模型的制备以及抗痛风药物的治疗效果测量血压与心率变化，处死后取胃和小肠进行大体损伤评价【16】，用以评估NSAIDs单用时的不良反应以及两药合用时CCBs的作用。【实验步骤】1、50只雄性SD大鼠，适应性喂养1周后随机分为5组，每组10只，分别为空白对照组、模型对照组、西尼地平治疗组、吲哚美辛治疗组和联合用药组。2、空白对照组不做处理，自由摄食、自由饮水；其他4组称重，以５％次黄嘌呤溶液10ml/（kg*d）灌胃7d制备高尿酸血症，每次灌胃半小时后均将大鼠以仰卧位包裹固定，用装有冰水混合物的小气球以纱布固定冰敷右下肢膝关节2h，诱导急性痛风性关节炎。3、每日冰敷完1h后，关节屈位，测量右下肢最大直径，每只大鼠取右下肢最大径与左下肢最大径的差值。每日冰敷完2h后观察大鼠步态并评分，评分标准为：正常行走记0分；轻微跛行，即右下肢略有弯曲，记1分；跛行，即右下肢可触及地面但明显弯曲，记2分；重度跛行，即右下肢不触及地面，仅三足行走，记3分。4、第3d开始给药，称重后，西尼地平治疗组以西尼地平1mg/（kg*d）灌胃，吲哚美辛治疗组以吲哚美辛3mg/（kg*d）灌胃，联合用药组合用上述剂量的西尼地平、吲哚美辛灌胃；空白对照组、模型对照组灌服等量生理盐水。5、第4d（24h后），每组大鼠各取5只，眼球取血收集血清，按照尿酸试剂盒说明测定血清中尿酸含量；同时取右下肢膝关节滑膜，固定于10%福尔马林内进行病理组织学检查。剩余大鼠继续给药直至第7d，每天测关节直径，观察步态，并测量血压和心率。6、末次给药24h后，剩余小鼠眼球取血测定血尿酸浓度，取关节滑膜进行病理检查，并取胃和小肠进行大体损伤评价：以胃粘膜为例，取出胃后沿胃大弯剪开胃壁、使胃腔粘膜外翻，生理盐水漂洗3遍后,以游标卡尺测定溃疡指数,按Guth标准详细记分。7、将记录的数据填入下表，并进行统计分析表1各组大鼠的两下肢最大径差值平均值的变化组别1d2d3d4d5d6d7d空白对照组模型对照组西尼地平组吲哚美辛组联合用药组表2各组大鼠的步态评分平均值的变化组别1d2d3d4d5d6d7d空白对照组模型对照组西尼地平组吲哚美辛组联合用药组表3不同治疗方案对各组大鼠血尿酸、关节滑膜、胃肠道的影响组别血尿酸浓度滑膜检查结果胃肠道损伤评价组别4d8d4d8d胃小肠空白对照组模型对照组西尼地平组吲哚美辛组联合用药组【预期实验结果】1、整个实验期间,空白组大鼠毛发光泽,双目有神,反应敏捷,进食正常。而给予次黄嘌呤灌胃加冰敷诱导的大鼠从第3d开始出现显著的右侧膝关节肿胀，与空白对照组比较，其两下肢最大径差值的增大、步态评分的上升以及4d时高于正常大鼠的血尿酸浓度均有统计学意义，并且关节滑膜组织可见大量炎细胞浸润及纤维蛋白渗出，伴充血、水肿、滑膜细胞及血管增生，有不同程度的变性、坏死，说明本实验中高尿酸血症与低温诱发的大鼠急性痛风性关节炎模型制备成功。2、开始给药治疗后，模型对照组大鼠的关节肿胀程度、步态评分、血尿酸浓度与滑膜病变程度可呈一定的上升趋势；西尼地平组大鼠血压下降，血尿酸浓度上升幅度明显小于模型组、甚至略有下降，且其关节肿胀程度、步态评分、滑膜病变程度略低于模型组（差异有统计学意义）；吲哚美辛组大鼠的关节肿胀程度、步态评分、滑膜病变程度显著下降，但无降低血尿酸浓度作用，且进行胃肠道损伤检查可见胃肠粘膜有较多的溃疡（差异有统计学意义）；联合用药组大鼠既可见关节肿胀程度、步态评分、滑膜病变程度显著减轻，又有血尿浓度的下降，并且胃肠道溃疡指数显著低于吲哚美辛单用组，同时有血压下降（差异有统计学意义）。 上述结果说明：西尼地平可通过降低血尿酸浓度来治疗痛风，而西尼地平与吲哚美辛合用时，可在增加痛风治疗效果的同时减少吲哚美辛引起的消化性溃疡等不良反应，对于临床上急性痛风性关节炎的治疗具有一定的意义，且尤其适用于伴有原发或继发性高血压的急性痛风性关节炎病人。【注意事项】1.给大鼠灌胃时保持大鼠口腔和食管成一直线，以免灌胃针刺破食管或误入气管。2.冰敷时保持大鼠右下肢伸直微曲，将含冰水混合物的小气球用纱布包裹放置于右下肢膝关节正上方，接触面覆盖膝关节正面和左右两侧。每半小时更换一次，保持低温。【参考文献】[1].陈灏珠.实用内科学[M].北京:人民卫生出版社,2005:2602[2].ChouCT，LaiJS．TheepidemiologyofhyperuricemiaandgoutinTaiwanaborigines［J］．BrJRheumatol，1998，37(3):258－262．[3].薛耀明.痛风的诊断与治疗[M].北京:人民军医出版社,2004:21-22[4].WortmannRL.Recentadvancesinthemanagementofgoutan-hype-ruricemia[J].CurrOpinRheumato,l2005,17(3):319-24.[5].Perez-RuizF,HernandoI,VillarI,eta.lCorrectionofallopurinoldosingshouldbebasedonclearanceofcreatinine,butnotplasmacreatininelevels.Anotherinsighttoallopurino-lrelatedtoxicity[J].ClinRheumato,l2005,11(3):129-33.[6].张照伟，傅继华．痛风的药物治疗新进展［J］．安徽医药，2011，15(4):408-410．[7].LiuCY,Sims-McCallumRP,SchifferCA.Asingledoseofras-buricaseissufficientforthetreatmentofhyperuricemiainpatientsreceivingchemotherapy[J].LeukemiaResearch,2005,29(4):463-5.[8].NielE,ScherrmannJM.Colchicinetoday[J].JointBoneSpine,2006,73(6):672-8.[9].李俊.解热镇痛抗炎药.见：杨宝峰.药理学.第8版.人民卫生出版社，2013.170[10].MIZUTAE,HAMADAT,IGAWAO,etal.Calciumant-agonist:currentandfutureapplicationsbasedonnewevidence.Themechan