DB32T-高粱属品种鉴定 InDel分子标记法编制说明

地方标准编制说明一、目的意义简述产业发展现状，制定标准的必要性、可行性，预期经济社会效益分析等。（一）产业发展现状我国高粱种植面积和产量正逐年增加。在中国酿造业拉动下，近年来高粱种植迅猛发展。高粱种植面积在2015-2021年间增幅58.86%，年均复合增长率约8.01%；产量增幅为42.26%，年均复合增长率约6.05%。高粱同时作为优良的饲草，2021年全国工业饲料产量已达29344万吨，环比增长5.4%。我国高粱产业化快速增长趋势已带动高粱种植业的显著进步。江苏作为我国酿酒产业强省之一，对高粱需求量大、品质要求高。江苏省苏北洪淮地区因其人文、地理优势集中了多个国内一流知名白酒企业（洋河、国缘等），2021年我省白酒产能已达10.18万吨。但省内现有高粱种植面积少，当前90%以上高粱原料依赖进口或外调，而原料品质将直接影响最终白酒的产量及品质，关系企业品牌价值。制定高粱品种鉴定技术规程，利于企业把控原料品种及品质。不同风味的白酒酿造所需高粱原料相差甚大，如酱香型贵州茅台专用品种为红缨子，而我省浓香和清香型白酒酿造的高粱原料以晋糯3号为主。流通的高粱品种不详、品质层次不齐的市场问题，显著不利于我省白酒企业的原料品种和质量把控。为了利于我省流通原料或种植高粱的市场监管，制定高精准、短周期的高粱品种鉴定技术规程，严格把控高粱品种的准确性，迫在眉睫。相较于SSR分子标记，InDel标记分辨率和精准度更高、鉴定周期更短。SSR（Simplesequencerepeats）作为基因组的重要序列缓冲带，保留了重组中的遗传特征并广泛用于遗传多样性分析，而SSR分子标记法仍存在片段差异小、难以精准分离/鉴定、操作性弱、分析效率低、运行成本高等缺点。InDel（Insertanddelete）是指一个基因型的基因组中相对于其他基因型有一定数量的核苷酸插入或缺失。根据InDel位点设计PCR引物的扩增标记即为InDel标记。该标记法优势在于：1).与目标基因功能关联，更利于分子辅助筛选和鉴定；2).可筛选片段差异大于50bp，便于分离和精准鉴定；3).分离方式可使用最常见的琼脂糖电泳，简捷、方便，分析周期短，运行成本低。目前在番茄等作物中已制定该标记相关的国家行业标准（NY/T2471-2013）。（二）必要性与可行性当前江苏省白酒酿造业的稳定、可持续发展迫切需要更精准、更高效的高粱原料分子鉴定技术规程，而SSR分子标记法分辨率低、分析周期长的缺点一定程度限制了我省流通原料或种植高粱的快速、精准鉴定。本项目立足于InDel标记分辨率和鉴定准确度高、操作性强、鉴定周期短、运行成本低等优势，基于泛基因组分析技术自主开发、筛选出包含酿用、粮用和饲用高粱在内的通用型InDel分子标记，为我省高粱属品种分子鉴定及品种权保护提供更有利的技术创新。现代分子遗传研究方法可直接比对出基因InDels。2021年权威期刊Nature子刊最新高粱属种质泛基因组分析显示，高粱属种间（拟高粱、苏丹草和甜高粱）基因结构变异已超过64%，大量重要农艺性状变异与主效基因的InDel特征关联。同时，泛基因组分析技术可直接筛选出编码基因内的结构变异，例如位于1号染色体的yellowseed1基因编码的MYB转录因子中存在大片段插入，造成不同高粱种质内外种皮颜色显著变异。因此，依据泛基因组分析设计重要性状的InDel标记，显著有利于我省高粱属育成品种的分子鉴定。（三）预期经济社会效益1.制定高粱属的InDel分子标记品种鉴定方法，将更加有效地保护育种者权益，保护原始创新。经查询农业农村部种业大数据平台（45/bigdataNew/home/ManageOrg），当前高粱品种权申请数为176个，授权70个，已登记品种761个。随着乡村振兴和地方特色经济的快速推进，高粱育种将更加活跃。高粱属InDel分子标记品种鉴定方法将为品种DUS测试过程中的近似品种筛选、特异性辅助判定提供快速手段。2.制定高粱属的InDel分子标记品种鉴定方法，将为规范高粱属种业市场提供技术支撑。目前高粱的已登记品种942个，常年推广应用品种100多个。除酿用、粮用高粱外，饲用高粱等育成品种已出现苏丹草杂交种“冀草6号”、高丹草“多糖”（甜高粱×苏丹草杂交种）、拟丹草“苏牧3号”（拟高粱×苏丹草杂交种）等近/远缘杂交后代。通用型InDel分子标记品种鉴定方法可为种子市场执法检查、纠纷鉴定提供快速、精准的依据与参考。3.制定高粱属的InDel分子标记品种鉴定方法，将为高粱实质性派生品种鉴定技术提供有益探索。实质性派生品种的概念和保护已写入新修订的《种子法》。是指由原始品种实质性派生，或者由该原始品种的实质性派生品种派生出来的品种，与原始品种有明显区别，并且除派生引起的性状差异外，在表达由原始品种基因型或者基因型组合产生的基本性状方面与原始品种相同。InDel分子标记品种鉴定方法可为快速分析遗传亲缘关系，利于实质性派生系的鉴定。二、任务来源说明项目来源文件。本标准研制任务由江苏省农业农村厅提出，根据《省市场监管局关于下达2023年度江苏省地方标准项目计划的通知》（苏市监标〔2023〕173号），由江苏省农业科学院承担《高粱书品种鉴定InDel分子标记法》的制定工作，项目编号115。三、编制过程按时间节点或工作进度简述编制过程。（一）起草阶段2022年01-08月。高粱属种质资源收集及扩繁。收集全世界高粱属种质资源276份。其中105份来源于贵州省旱粮研究所，80份来源于国家农作物种子资源中期库（江苏），91份来源于江苏省牧草种质资源库。对276份高粱属种质进行浸种催芽、取样和提取DNA。2022年08-12月。高粱属InDel位点筛选。对已发表的13个参考基因组进行大片段比对并筛选片段>25bp的高频二态性缺失位点，并依据染色体物体图谱均匀分布的筛选原则，共计获得有效InDel位点540个。2023年01-03月。高粱属InDel位点引物筛选。对276份高粱属种质DNA等份混合获得12个基因池，筛选560个InDel位点的引物，获得高频位点111个。2023年04-12月。高粱属核心InDel标记的确定。优化111个位点的引物至琼脂糖电泳无杂带后，对276份高粱属种质逐一进行分析，获得遗传多样性矩阵。进行聚类等差异分析后发现，可完全区别276份高粱属种质。依据染色体物体图谱均匀分布的筛选原则，每条染色体保留不同物理位置的标记共6条，且PCR扩增产物在1200bp之内（荧光毛细管电泳的最大检出区间），并结合对276份种质的区分力，最终获得60对InDel核心引物。2024年01-06月。核心标记测序和毛细管荧光电泳验证。依据高粱属Harlen&Wet的Bicolor/Caudatum/Durra/Guinea/Kafir分类法，挑选以上5类中的6个代表性种质：BTx623、Rio、Tx430、红缨子、甜高粱江苏地方种和苏丹草2098。对以上60对核心InDel引物的6个代表性种质PCR扩增片段逐一基因Sanger测序验证，测得序列Blast参考基因组后确定与设计位点的物理位置和序列相同，6个代表性种质的测序片段比对后确认InDel真实存在，且无第三等位片段。对正向引物5’碱基进行6-FAM荧光标记修饰后，进行核心引物PCR产物的毛细管荧光电泳，扩增的PCR产物均能获得清晰、稳定的主峰，且易于识别，并确认6个代表性种质的片段多态性与测序大小相符。（二）征求意见阶段2024年07-08月。成立了由江苏省农业科学院、中国农业科学院生物技术研究所、贵州省旱粮研究所等单位组成的标准起草小组，经研讨修改形成标准征求意见稿。截止目前，已书面征求了科研教学、种子管理、新品种管理、种子检验机构等方面20位高级职称专家意见，共收到100条，采纳58条，部分采纳8条，不采纳34条。根据相关意见修改形成送审稿。（三）审定阶段暂无（四）报批阶段暂无四、主要内容技术指标确立简述标准主要内容技术指标确定的依据，包括实地调研、查阅资料、试验论证等。（一）编制原则根据高粱属品种的特点，按照农业农村部制定的《植物品种鉴定DNA分子标记法总则》标准编写要求，采用以下原则编写《高粱属品种鉴定InDel分子标记法》：规范性原则：本标准的制定符合法律法规，符合有关标准要求，包括GB/T1.1-2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》、GB/T3543.1《农作物种子检验规程总则》、GB/T3543.2《农作物种子检验规程扦样》、GB/T6682《分析实验室用水规格和试验方法》。适用性原则：本规程的全部内容具有可操作性，本标准适用于高粱属各类（酿用、粮用和饲用）高粱及苏丹草品种的鉴定。统一性原则：本规程与现行相关标准协调统一，不发生冲突。先进性原则：本规程采用利用国际前沿的泛基因组分析技术获得高粱属基因组二态性、大片段、高频InDel位点并开发InDel标记，以琼脂糖凝胶电泳结合荧光毛细管电泳的高粱属鉴定技术，证明采用InDel标记技术检测高粱属品种真实性可以保证检测结果的规模化、准确性和时效性。该方法的先进性在于检测方法简便、时间短、数据统计分析简单、易实现数据共享、重复性稳定性较高。（二）标准主要内容1.样品DNA提取方法鉴于市场流通的高粱多以种子形态为主，本标准除了采用常规CTAB提取叶片等组织样品的DNA方法，还额外增加了SDS提取种子粉末DNA的方法，利于市场纠察中种子品种及纯度的检测。因高粱种子粉末内淀粉和蛋白质含量过高，常规的CTAB法提取后的DNA浓度低、杂质多且完整性较差（图1-1），相比SDS裂解法提取高粱种子粉末后的DNA浓度、纯度和完整性更好（图1-2）。图1CTAB法和SDS法提取高粱种子DNA后的电泳比较。2.引物筛选利用已发表13个高粱属不同种质基因组序列与高粱测序品种BT×623参考基因组序列进行比对。利用软件MUMmer进行大片段同源序列比对筛选目标区域中序列差异≥25bp的InDel位点560个，利用PrimerPremier6.0软件设计InDel标记引物。引物设计的条件：PCR扩增产物长度为100-1200bp；变性温度（Tm）在54-63℃之间；引物长度在18-30bp。本标准自主开发了一种快速预测Indel标记最小等位基因频率的方法，在不需要逐一分析大群体中单个样品的前提下，快速准确的测算出该标记的MAF值。具体方法为：将种质资源分别提取DNA后，n数量基因型等份混池共获得N个混池样品，再分别对N个混池DNA进行特异引物的PCR，所得N个产物二次混池为一个最终产物，利用4%琼脂糖进行电泳分离，对同一泳道上的不同Indel条带强弱进行量化分析后，计算MAF（%）=Intensity(弱带)/[Intensity(弱带)+Intensity(强带)]*100。预测MAF方法如图1所示。因此，等体积取母液浓度为200ng/μL的单个种质DNA并随机混合13个种质DNA于一个离心管内即为一个混池DNA样品，276个种质共计获得12个混池DNA样品。利用合成的560对引物对12个混池DNA样品进行PCR，扩增程序为63-57℃的降落PCR。扩增结束后将12个混池DNA的PCR产物混匀至一个离心管内后，在进行4%浓度的琼脂糖凝胶电泳。经以上方法预测出111对InDel引物的MAF>5%。图2高粱属Indel标记MAF预测流程。3.核心引物的确定利用筛选出的111对高频InDel引物对276份高粱种质DNA进行逐一分析，依据其二态性获得遗传多样性矩阵，并利用Neighbor-joining(NJ)聚类法构建系统发育树，如图3-A所示。为了便于观察引物的区分力，特在数据组中插入JS172VSJS172_2的重复对照，JS172和JS172_2的多态性数据完全相同。结果显示，除JS172VSJS172_2（图3-A，红色）以外，其他种质间均存在显著遗传距离，说明115对高频InDel引物可完全区分276份高粱属种质。依据引物对物理位置、MAF值及兼容毛细管荧光电泳（最大片段<1200bp）的原则，优选60对引物构建NJ系统发育树，如图3-B所示。结果中仍然除JS172VSJS172_2（图3-B，红色）以外，其他种质间均存在显著遗传距离，说明该60对引物的区分力足以辨别276份高粱属种质，特认定为核心引物，编号WS01-60。此外，将核心60对引物数量将至30个后的高粱属种质遗传多样性矩阵进一步构建NJ系统发育树，如图3-C所示，出现了除JS172VSJS172_2对照外的大量种质重复，说明缩减60对核心降低了种质区分力。分别对以上60对引物的扩增产物进行Sanger双向测序后并BLAST高粱属测序品种BT×623参考基因组，确认其扩增序列染色体物理位置与设计位置相符。具体物理位置如图4所示。依据高粱属数据库中品种间差异位点的分布，综合考虑实际检测过程中种子批次、试剂等对检测结果的影响，结合DUS表型数据并参考国家行业标准，将检测结果判定阈值定为2，当2个样品差异位点数≤2时，判定为“疑同”；差异位点数＞2，判定为“不同”。图3高粱属276份种质的系统发育树对比。图4高粱属60对核心Indel标记染色体物理图谱。4.引物带型和峰型以4%琼脂糖电泳对参考样品BTx623、Rio、Tx430、红缨子、甜高粱江苏地方种、苏丹草2098/苏牧3号6组样品的60对核心引物进行电泳，其电泳带型如图5所示。仅甜高粱江苏地方种在WS11引物出现缺失位点，其他核心引物中至少有一份种质的InDel多态性与其他种质不同。WS04引物为拟高粱特异标记，仅在含有拟高粱遗传背景的苏牧3号中有特异带。WS14引物中仅苏丹草含有杂合带型。以毛细管荧光电泳对以上参考样品的60对荧光修饰引物PCR产物进行验证，其WS04和WS05的毛细管全谱比较如图6所示，谱图中均检测到显著单峰。60对核心引物的荧光毛细管电泳单峰比较如7所示，所得PCR产物大小与Sanger测序结果相符。图5高粱属60对核心Indel标记的琼脂糖电泳条带图。图6高粱属Indel标记毛细管荧光电泳全谱比较。图7高粱属60对核心Indel标记的毛细管荧光电泳单峰比较。5.DNA指纹数据库的建立利用60对核心InDel引物对276份高粱属种质进行遗传多样性检测，建立高粱属品种保护InDel指纹数据库。6组参考样品BTx623、Rio、Tx430、红缨子、甜高粱江苏地方种、苏丹草2098/苏牧3号的InDel位点多态性大小（bp）如表1所示。60对核心InDel引物MAF值范围为2.8-49.3%，平均MAF值为29.21%。仅WS04标记MAF值＜5%，其他均高于5%。60对引物仅在WS11位点出现部分缺失，缺失率低，可用性好。表1高粱属60对核心Indel标记遗传多态性。引物名称染色体位置参照品种InDel位点多态性（bp）MAF(%)BTx623RioTx430红缨子甜高粱地方种a苏丹草/b苏牧3号1WS011115012312311501150a115043.11WS021241428428428428a42826.11WS031778778529529529a77827.51WS041816816816816816b3282.81WS05147711534771153477a115335.92WS061301301259301301a30110.11WS072351296296296296a29625.01WS082283496283496496a49633.31WS092132180180132180a13228.61WS102243243243590590a24339.51WS112277501277501/a27748.91WS122814814814515515a81423.91WS133278278355355355a35519.21WS143689418689418689ac418/68946.31WS153257529529257529a25732.61WS163195195567195195a19510.92WS1731141114111414261141a114140.02WS183959959644959959a95949.32WS194161161161209161a20944.91WS204158107158107107a15827.51WS214302302302219219a30240.21WS224539310310310310a53930.81WS234187187187435435a43529.31WS244263486486486486a48629.72WS255406190190190190a19015.91WS265123123150123123a12326.11WS275264362362264362a26443.52WS285193193193193193a87918.51WS295531531531170170a17014.51WS305211247211247247a21142.01WS316500149500500500a14919.21WS326491658658658658a65825.71WS336257257257502502a25743.81WS346597362362362362a36210.91WS356128168128128128a12823.61WS366498153153153153a15312.01WS377156156885885885a15637.31WS387298298485298298a2988.71WS3971005156156156156a15610.51WS407300300300300300a3486.91WS417396396396335335a33549.31WS427225225458225225a22521.01WS438184184184422422a18449.32WS448190190190190190a25638.81WS458373136136373373a37327.51WS468172172418418418a17244.61WS478416179179179416a41618.81WS488833833599599599a59919.91WS499353353353146146a35340.61WS509183123123123123a18316.31WS51943543543