纳米技术 基于NADH氧化的纳米颗粒光催化活性测试 征求意见稿

1GB/TXXXXX—XXXX/ISO20814:2019纳米技术基于NADH氧化的纳米颗粒光催化活性测试本文件规定了一种测量纳米颗粒（NP）光催化活性（PCA）的方法。该方法将NP悬浮于生理环境相关的水溶液中，测定其在紫外光（UV）辐照下导致的还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）氧化。本文件旨在评估纳米材料产生光毒性的能力。该方法也适用于NP团聚体和聚集体。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。ISO/TS80004-1纳米科技术语第1部分：核心术语（Nanotechnologies—Vocabulary—Part1:Coreterms）注：GB/T30544.1—2014纳米科技术语第1部分：核心ISO/TS80004-2纳米科技术语第2部分：纳米物体（Nanotechnologies—Vocabulary—Part2:Nano-objects）3术语、定义、符号和缩略语ISO/TS80004-1和ISO/TS80004-2界定的以及下列术语和定义适用于本文件。3.1术语和定义3.1.1光量测定法actinometry测量规定时间内的光子数或单位时间光子数的方法。3.1.2催化活性catalyticactivity对于指定的化学反应，测量在规定的测试条件下，因催化导致的物质转化速率的变化。[来源：ISO18153:2003，3.2，有修改，删除所有注]3.1.3氧化oxidation有机底物获得氧、损失氢或分子失去一个或多个电子的化学反应。3.1.4NADH等效比PCANADHequivalentspecificPCA单位质量纳米颗粒催化NADH光氧化（3.1.5）的速率。3.1.5光氧化photo-oxidation2GB/TXXXXX—XXXX/ISO20814:2019光引发的氧化反应。3.2符号和缩略语以下符号和缩略语适用于本文件。DIW：电阻率≥18MΩ∙cm的去离子水（deionizedwaterwith≥18MΩ∙cmresistivity）NADH：还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotineadeninedinucleotidehydrate）NaOH：氢氧化钠（sodiumhydroxide）2NB：2-硝基苯甲醛（2-nitrobenzaldehyde）NP：纳米颗粒（nanoparticle）PB：磷酸盐缓冲液（phosphatebuffer）PCA：光催化活性（photocatalyticactivity）ROS：活性氧（reactiveoxygenspecies）TI：透射仪（trans-illuminator）TiO2：二氧化钛（titaniumdioxide）UV：紫外光（ultraviolet）UV-Vis：紫外-可见（ultravioletandvisible）Ac(i,j)：UV透射仪曝光前，每个孔中酚酞的吸光度（i=B,C,D,E,F,G；j=2,3,4,…,10,11）Ae(i,j)：UV透射仪曝光后，每个孔中酚酞的吸光度（i=B,C,D,E,F,G；j=2,3,4,…,10,11）∆A(i,j)：UV透射仪曝光后，每个孔中酚酞吸光度的变化（i=B,C,D,E,F,G；j=2,3,4,…,10,11）∆Aa：UV透射仪照射前后所有孔中酚酞吸光度变化的平均值C0：用于制备稀释测试溶液的NP悬浮液的初始浓度；悬浮液在310nm或365nm处（取决于使用的UV透射仪）的吸光度为1.4<A<1.6C(i,j)：每个孔的光强校正因子，用于校准UV透射仪在每个孔位置处的光照强度变化（i=B,C,D,E,F,G;j=2,3,4,…,8,9）IF,0(i,j)：UV照射前，每个孔中NADH的荧光强度（i=B,C,D,E,F,G；j=2,3,4,…,8,9）IF,t(i,j)：UV持续照射t时间后，每个孔中NADH的荧光强度（i=B,C,D,E,F,G；j=2,3,4,…,8,Kapp(i,j)：每个孔中NADH的表观光氧化速率，单位为μmol/min（i=B,C,D,E,F,G;j=2,3,4,…,8,λexc：多孔板读取器上设定记录荧光的激发波长λexs：多孔板读取器上设定记录荧光的发射波长Aλ(max)：在300nm～800nm波长范围内NP悬浮液的最大吸光度λ(max,TI)：UV透射仪提供的最大光强处的波长S(i,j)：每个孔中NADH荧光强度随UV照射时间变化的斜率（i=B,C,D,E,F,G;j=2,3,4,…,8,9）Sc(i,j)：每个孔中透射仪光强变化校准后的S(i,j)b：线性范围内kapp随NP浓度变化的斜率，单位为mmol∙min-1∙g-14测试方法说明本文件中，水悬浮液中NP的PCA采用其悬浮液中NADH的光氧化速率进行测量。通过检测UV光连续照射后NADH荧光强度的降低，可以测出由NP光催化作用而氧化的NADH比例。利用NP浓度梯度稀释的方法，测定若干NP浓度下NADH的光氧化速率，由此得到NADH光氧化速率与NP浓度呈线性关系的NP浓度范围[6]。该线性范围内的光氧化斜率给出了水悬浮液中单位浓度NP引起的NADH光氧化速率。利用96孔板、UV透射仪和多板光学读取器提供的多通道检测可以实现快速准确的测量。96孔平台可3GB/TXXXXX—XXXX/ISO20814:2019以同时测量系列NP浓度，并提供了可作为阳性和阴性对照的参比NP选项。这个选项表示无NP时UV照射下NADH的自氧化和NP的自生荧光。5试剂与仪器5.1试剂5.1.1NADH，还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，CAS号：606-68-8a）NADH储备溶液：1）将约35mgNADH溶解在10mL浓度为5mmol/L的磷酸盐缓冲液（pH=8）中。b）NADH工作溶液：1）将NADH储备溶液用5mmol/L磷酸盐缓冲液（pH=8）稀释20倍；2）得到的NADH工作溶液的浓度约为250μmol/L；3）通过测量该溶液在λ=339nm处的吸光度确定NADH工作溶液的浓度[NADH]。如有必要，使用5mmol/L磷酸盐缓冲液稀释或添加NADH储备溶液调整NADH浓度使得吸光度A339=1.56±0.05。5.1.22-硝基苯甲醛（2NB），CAS号：552-89-6a）将0.756g无水2NB溶解在50mL50/50DIW/乙醇（体积比）混合溶剂中，得到50mL0.1mol/L2NB溶液。b）加入0.03mol/LNaOH，将0.1mol/L2NB溶液的pH调至12±0.2。5.1.3酚酞，CAS号：77-09-8a）将20mg无水酚酞溶解在20mL50/50DIW/乙醇（体积比）混合溶剂中，得到20mL酚酞储备溶液。b）将100μL酚酞储备溶液添加到50ml0.1mol/L2NB溶液中（按5.1.2制备溶液变成粉红色。c）将溶液在避光瓶中（琥珀色玻璃或铝箔包裹）储存。5.1.4磷酸盐缓冲液，pH=8的磷酸钠/磷酸二钠缓冲液（pH=8时PB为5mmol/L）2）将0.041g磷酸二氢钠一水合物（CAS：10049-215.1.5NP悬浮液a）根据推荐的纳米材料特定分散方法（如文献[7]在5mmol/L磷酸盐缓冲液中配制50mLNP悬浮液。b）将NP分散液的浓度调整为C0，使其在300nm～800nm范围内的最大吸光度满足1.4<A<1.6。计算调整后储备溶液中NP的浓度C0（mg/L）。c）根据配制的NP储备溶液的质量浓度，可以计算出所需NP工作溶液的稀释倍数。5.1.6无水乙醇，纯度>99.5%，含水量<0.005%，CAS：64-17-55.2仪器4GB/TXXXXX—XXXX/ISO20814:20195.2.1UV-Vis分光光度计，波长范围：190nm～800nm，吸光度范围：0.1～3.0。5.2.2UV-Vis吸收测量用比色皿，石英或光学玻璃，光程1cm。5.2.396孔板，平底面在λ(max,TI)处的透光率T>60%，首选侧面为深色的塑料。5.2.4多孔板的吸收和荧光读取器，可在300nm～800nm范围读取吸收和荧光的测量数据。5.2.5多通道移液器，不低于6通道，每个通道最大量程300μL。5.2.6300μL移液器枪头，与多通道移液器匹配。5.2.7UV透射仪，水平照射面积不小于96孔板的365nm光源。6测量程序6.1NP悬浮液基本性质测量6.1.1UV-Vis吸收光谱测量在300nm～800nm范围的UV-Vis吸收光谱。参比和样品尽量使用同一比色皿进行测量。b）如果悬浮液在λ(max)处的Aλ(max)超过1.6，用磷酸盐缓冲液（5mmol/LPB，pH=8）稀释悬浮液至1.4<Aλ(max)<1.6。如果低于1.4，则相应地增加NP的浓度。6.1.2NP悬浮液稳定性测量注：此为确保NP在测量期间保持悬浮状态所必需的。a）用5mmol/LPB（pH=8）测量基线（参比吸光度）。b）测量NP工作悬浮液的UV-Vis吸收光谱，按6.1.1调整浓度。c）将比色皿在分光光度计中放置20min后，再次测量工作悬浮液的UV-Vis吸收光谱。d）比较两个光谱，并确认在最大吸收λ(max)处吸光度的变化小于5%。如果λ(max)处的吸光度在20min内下降超过5%，则认为NP工作悬浮液不稳定。6.2基于2NB光量测定法的UV透射仪光强校准a）按照5.1.2和5.1.3配制含有酚酞的50mL0.1mol/L2NB溶液。使用琥珀色玻璃容器储存该溶b）用300μL上述制备的溶液填充96孔板的每个孔。c）将96孔板放入读数器中，设置程序使板摇动5s，并测量和记录540nm处的吸光度Ac(i,j)。警告：放置多孔板的位置和方向要与NADH/NP的UV曝光位置和方向相同。按照附录A中的说明确定孔板的放置。d）打开透射仪（波长为λ(max,TI)）并预热30min。e）将96孔板放置于透射仪上。f）将多孔板在UV下曝光10min。g）10min后，关闭透射仪，测量并使用96孔板上的读取器记录540nm处的吸光度Ae(i,j)。h）将步骤g）中记录的每个孔的吸光度值减去步骤c）中记录的对应吸光度值，如式(1)所示：5GB/TXXXXX—XXXX/ISO20814:2019∆A(i,j)=Ae(i,j)-Ac(i,j) i）计算吸光度差值的平均值，如式(2)所示：j）计算每个孔的光强校准因子，如式(3)所示：C(i,j)=∆Aa/∆A(i,j) (3)k）每个孔的光强校准因子乘以NADH荧光下降的斜率，按中的式（5）计算。附录B给出了UV透射仪光强的校准实例。6.3NADH溶液荧光强度的测量6.3.1不同NP浓度的NADH光氧化速率测量按5.1.1配制250μmol/LNADH溶液。配制NP悬浮储备溶液（使用适当的分散步骤，参见5.1.5）C0=100%。λ(max)处的吸光度（在300nm～800nm的范围内）宜1.4<A<1.6。通过体积稀释，配制系列浓度的NP悬浮液（使用磷酸盐缓冲液，每个浓度2mL）。相对于C0=100%（参见NP悬浮液的浓度分别为100%、80%、60%、40%、20%、10%、8%、5%。将100μL250μmol/LNADH溶液加入白色标记的孔，如图1所示。）；浓度为C0的NP悬浮液和100μL磷酸盐缓冲液（图1用96孔板测定不同NP浓度的NADH光氧化速率示意图按以下说明，将100μL系列浓度的NP悬浮液填充至相应孔中，通过移液器吹打至少3次使得各孔中的溶液混合均匀。—A1,B1,……,G1,H1（整列）：不使用—A2,A3,……,A10,A11（整行）：不使用—B2,C2,D2,E2,F2,G2：空白缓冲液—B3,C3,D3,E3,F3,G3：浓度为C0的NP悬浮液6GB/TXXXXX—XXXX/ISO20814:2019—B4,C4,D4,E4,F4,G4：浓度为80%C0的NP悬浮液—B5,C5,D5,E5,F5,G5：浓度为60%C0的NP悬浮液—B6,C6,D6,E6,F6,G6：浓度为40%C0的NP悬浮液—B7,C7,D7,E7,F7,G7：浓度为20%C0的NP悬浮液—B8,C8,D8,E8,F8,G8：浓度为10%C0的NP悬浮液—B9,C9,D9,E9,F9,G9：浓度为8%C0的NP悬浮液—B10,C10,D10,E10,F10,G10：浓度为5%C0的NP悬浮液—B11,C11,D11,E11,F11,G11：100μL浓度为C0的NP悬浮液和100μL磷酸盐缓冲液（5mmol/LPB，pH=8）—A12,B12,……,G12,H12（整列不使用—H2,H3,……,H10,H11（整行）：不使用测量并记录每个孔的荧光强度值(λexc=340nm和λems=460nm应标记为IF,0(i,j)，其中i为B~G的行数，j为2～11的列数。将96孔板放置于UV透射仪上，开灯1min。在多孔板曝光前，宜打开UV透射仪30min。在多孔板多次UV曝光期间，确保其与UV曝光位置和方向相同。多孔板的放置说明参见附录A。测量并记录每个孔的荧光强度值，应标记为IF,t(i,j)，其中t为UV的曝光时长。重复步骤和，直到孔B6、C6、D6、E6、F6和G6中的荧光强度下降到其初始值的50%以下（UV曝光之前）。6.3.2不同NP浓度的NADH光氧化速率计算将每个孔测量的荧光强度IF,t(i,j)按IF,0(i,j)归一化为UV照射时间的函数，如式(4)所示：IF,t,N(i,j)=IF,t(i,j)/IF,0(i,j)…………其中：j绘制每个孔的归一化强度IF,t,N(i,j)随照射时间的函数，并在下降强度与照射时间呈线性相关的范围内进行线性回归。计算每个孔的斜率S(i,j)，并乘以6.2中获得的C(i,j)，获得UV照射强度的校准斜率，如式(5)所示：Sc(i,j)=S(i,j)×C(i,j) (5)使用5.1.1中吸光度测量获得的[NADH]值，计算每个孔的NADH光氧化率kapp(i,j)，如式(6)所示：kapp(i,j)=Sc(i,j)×[NADH] (6)计算每个NP浓度下kapp值的列平均值和标准偏差。由于kapp(2,j)仅为NADH自身的光氧化值（第2列数据通过计算kapp(i,j)/kapp(2,j)的比值可对kapp进行归一化处理。特定NP浓度下的kapp平均值和标准偏差可以通过此列读数计算出来。如果斜率Sc(i,j)>0，则舍弃数据，报告中kapp(i,j)=0。绘制归一化的kapp值随NP浓度的关系图，NP浓度单位为mg/L。速率常数与浓度关系图的实7GB/TXXXXX—XXXX/ISO20814:2019例如图2所示。在线性范围内，kapp随NP浓度的斜率b给出了单位质量NP的NADH光氧化速率，单位为mmol∙min-1∙g-1。该值可以称为NP的“NADH等效比PCA”。图2NADH光氧化速率随NP浓度的关系7检测报告7.1信息检测报告应包括以下信息：—对本文件的引用，如：根据本文件测定；—检测实验室的名称；—样品的所有详细信息（生产商名称、生产日期、批号、纯度、颗粒尺寸、预期用途、安全数据表）；—如果使用阴性对照，其所有详细信息（生产商名称、生产日期、批号、纯度、颗粒尺寸、安全数据表）；—如果使用阳性对照，其所有详细信息（生产商名称、生产日期、批号、纯度、颗粒尺寸、安全数据表）；注：按照上述完整的测量方案获取对照数据。—根据6.1.2，5mmol/L磷酸盐缓冲液中NP悬浮液的吸收光谱；—NADH生产商名称及纯度；—酚酞生产商名称及纯度；—2NB生产商名称及纯度；—乙醇生产商名称及纯度；—透射仪生产商名称及型号；—96孔板生产商名称及型号；8GB/TXXXXX—XXXX/ISO20814:2019—96孔板读取器生产商名称及型号；—用于吸光度和荧光测量的96孔板读取器设置的详细说明；—结果评估，包括统计方法。7.2报表数据格式7.2.1通过光量测定法（参见6.2）获得的校准因子C(i,j)每个孔的光强校准因子C(i,j)如表1所示。表1光强校准因子123456789ANANANANANANANANANANANANABNAC(B,2)C(B,3)C(B,4)C(B,5)C(B,6)C(B,7)C(B,8)C(B,9)C(B,10)C(B,11)NACNAC(C,2)C(C,3)C(C,4)C(C,5)C(C,6)C(C,7)C(C,8)C(C,9)C(C,10)C(C,11)NADNAC(D,2)C(D,3)C(D,4)C(D,5)C(D,6)C(D,7)C(D,8)C(D,9)C(D,10)C(D,11)NAENAC(E,2)C(E,3)C(E,4)C(E,5)C(E,6)C(E,7)C(E,8)C(E,9)C(E,10)C(E,11)NAFNAC(F,2)C(F,3)C(F,4)C(F,5)C(F,6)C(F,7)C(F,8)C(F,9)NAGNAC(G,2)C(G,3)C(G,4)C(G,5)C(G,6)C(G,7)C(G,8)C(G,9)C(G,10)C(G,11)NAHNANANANANANANANANANANANANA：不使用。注：需λ(max,TI)来确定哪些数据组能相互比较。分别使用λ(max,TI)=312nm和λ(max,TI)=365nm的UV透射仪获得的数据不能7.2.2NADH荧光下降的校准斜率每个孔的NADH荧光强度随UV照射时间的校准斜率Sc(i,j)（参见）如表2所示。表2NADH荧光强度随UV照射时间的校准斜率123456789ANANANANANANANANANANANANABNASc(B,2)Sc(B,3)Sc(B,4)Sc(B,5)Sc(B,6)Sc(B,7)Sc(B,8)Sc(B,9)Sc(B,10)Sc(B,11)NACNASc(C,2)Sc(C,3)Sc(C,4)Sc(C,5)Sc(C,6)Sc(C,7)Sc(C,8)Sc(C,9)Sc(C,10)Sc(C,11)NADNASc(D,2)Sc(D,3)Sc(D,4)Sc(D,5)Sc(D,6)Sc(D,7)Sc(D,8)Sc(D,9)Sc(D,10)Sc(D,11)NAENASc(E,2)Sc(E,3)Sc(E,4)Sc(E,5)Sc(E,6)Sc(E,7)Sc(E,8)Sc(E,9)Sc(E,10)Sc(E,11)NAFNASc(F,2)Sc(F,3)Sc(F,4)Sc(F,5)Sc(F,6)Sc(F,7)Sc(F,8)Sc(F,9)Sc(F,10)Sc(F,11)NAGNASc(G,2)Sc(G,3)Sc(G,4)Sc(G,5)Sc(G,6)Sc(G,7)Sc(G,8)Sc(G,9)Sc(G,10)Sc(G,11)NAHNANANANANANANANANANANANANA：不使用。7.2.3kapp随NP浓度的关系图应绘制kapp随NP浓度的关系图，确定浓度的线性范围（参见）。当线性范围确定（参见图2），应在此NP浓度范围内对kapp随NP浓度进行线性回归，并计算斜率。9GB/TXXXXX—XXXX/ISO20814:20197.2.4NADH等效比PCA在线性范围内，测试样品的kapp随NP浓度的斜率b为单位质量NP催化NADH的光氧化速率，称为NP的“NADH等效比PCA”，单位为mmol∙min-1∙g-1。重复测量6次（96孔板的B行～G行），并记录平均值±标准偏差。对于阴性对照，按处理。对于阳性对照，按处理。8精密度8.1重复性在同一实验室，同一操作人员使用相同的实验和分析测量仪器，在短期内对同一样品进行两次独立测量。两次测量的绝对差值不得超过重复性极值r，即不大于测试值的5%。附录C给出了典型的实验室间测试中6个实验室的精度数据。8.2复现性在不同的实验室，不同的操作人员使用不同的实验和分析测量仪器，使用相同的测试方法，对同一样品进行两次独立测量。两次测量的绝对差值不得超过复现性极值R，即不大于测试值的5%。附录C给出了典型的实验室间测试中6个实验室的精度数据。GB/TXXXXX—XXXX/ISO20814:201996孔板放置示意图遮蔽块确保96孔板每次在UV透射仪上都放置在同一位置，如图A.1所示。标记多孔板方向，避免方向放反。遮蔽块可以是聚四氟乙烯（PTFE）、铝箔或黑色厚纸。标引序号说明：1——96孔板的位置（UV照射）表A.196孔板GB/TXXXXX—XXXX/ISO20814:2019UV透射仪光强的校准实例UV透射仪光强校准实例的步骤如下：a）根据5.1.2，配制50mL100mmol/L2NB溶液。使用琥珀色玻璃容器储存该溶液。b）用300μL上述制备的溶液填充96孔板的每个孔。c）将96孔板放入读取器中，摇动5s，记录60孔中每个孔在540nm处的吸光度。2NB的初始吸光度实例如表B.1所示。图形表示如图B.1所示。表B.12NB的初始吸光度Ac(i,j)123456789AB0.30800.30100.28600.29700.29700.30300.30200.29700.31000.3170C0.30500.30700.30100.29500.29700.29300.30100.30500.30800.3120D0.30900.30700.30600.30000.29400.29000.29900.30500.30800.3140E0.31100.31200.31100.30300.29600.29500.29600.30800.31100.3140F0.31100.31500.31200.30800.30200.30000.30700.30800.31300.3210G0.32600.32000.31800.31700.31700.31600.32100.31700.31900.3260H注：每个孔中均含有300μL2NB溶液。图B.196孔板中100mmol/L2NB溶液的初始吸光度(λ=540nm)图示GB/TXXXXX—XXXX/ISO20814:2019使用板定位器将96孔板放置于透射仪上。d）打开透射仪(λ=365nm），将多孔板曝光10min。e）10min后，关闭透射仪，并使用96孔板上的读取器测量540nm处的吸光度（参见表B.2）。图形表示如图B.2所示。表B.2UV曝光10min后2NB的吸光度Ae(i,j)123456789AB0.20800.20700.20800.20800.20700.20700.20700.20600.20700.2070C0.20700.20800.20900.20800.20800.20800.20800.20800.20800.2070D0.20800.20800.21000.21000.20700.20800.20900.20700.20700.2080E0.21000.20900.20900.21300.21000.20800.20800.20700.20800.2070F0.20800.21300.20900.20800.21000.20900.20800.20700.20700.2100G0.21400.21300.20900.20800.20900.20900.21100.20800.20800.2090H注：每个孔中含有300μL2NB溶液。图B.2透射仪(λ=365nm)曝光10min后96孔板中100mmol/L2NB溶液的吸光度(λ=540nm)图示f）将步骤c）中记录的每个孔的吸光度值减去步骤e）中记录的对应吸光度值，如式(B.1)所示：结果参见表B.3。图形表示如图B.3所示。GB/TXXXXX—XXXX/ISO20814:2019表B.3UV曝光10min后2NB吸光度的差值∆A(i,j)123456789AB0.09900.09200.08700.08900.08500.09300.09700.10000.10500.1140C0.09900.09600.09000.08700.08200.09000.09800.10100.10600.1220D0.10300.10200.09000.08600.08700.08800.10100.10300.10700.1170E0.10200.10300.10000.09200.09100.09900.10100.10600.11100.1180F0.10700.10900.10900.10800.10700.11000.10900.11100.11700.1230G0.11100.11000.11000.10900.11600.11500.11500.11900.12000.1180H注：每个孔中含有300μL2NB溶液。图B.3透射仪(λ=365nm)曝光10min后96孔板中100mmol/L2NB溶液的吸光度(λ=540nm)变化∆A(i,j)计算吸光度差值的平均值，如公式(B.2)所示：g）计算每个孔的光强校准因子，如公式(B.3)所示：结果参见表B.4。图形表示如图B.4所示。GB/TXXXXX—XXXX/ISO20814:2019表B.4光强校准因子C(i,j)123456789AB1.03131.20121.09781.05261.02100.97240.8956C1.03131.06351.24511.04181.01090.96320.8369D0.99131.00101.01090.99130.95420.8726E1.00100.99131.02101.03131.01090.96320.91980.8653F0.95420.93670.93670.94540.95420.92820.93670.91980.87260.8301G0.91980.92820.92820.93670.88020.88780.88780.85800.85080.8653H注：每个孔中含有300μL2NB溶液。图B.4每个孔的光强校准因子GB/TXXXXX—XXXX/ISO20814:2019TiO2NPPCA的实验室间比对研究C.1研究方式日本产业技术综合研究所（Japan）、泰国计量研究所（Thailand）、亚利桑那大学（Arizona）和韩国每个参与实验室都获得了10gNISTSRM1898（二氧化钛粉体）。根据已发布文献[7]中的方案将此纳米材料分散在PBS水溶液中，可获得平均粒径为75nm的单峰TiO2NP。材料为锐钛矿（带隙Eg=3.2eV）和金红石（Eg=3.02eV）相的混合物，比例约为3:1。所以，两个组分都能被透射仪的UVA光激活（峰值波长λ=365nm，对应的光子能量E=3.4eV）。其他所有试剂和设备均为当地采购。NIST统计工程部采集并分析了96孔板读取器以1min间隔测量的NADH荧光强度数据。6家实验室在96孔板上均使用相同的设计。在t=0、1、2、……、10min时，分别对第2列～第10列中每个孔中荧光强度进行6次（对应6列）重复测量。t=1min时，测量实例参见表C.1。表C.1在365nm暴光1min后96孔板中NADH荧光强度测量实例NADH0注：C0为梯度稀释前TiO2NP储备溶液的浓度。C.2数据分析计算从第1min开始每个时间点的每个孔，与0min时的对于孔的荧光强度比值。该比值称为pijk，i=1,…,9，j=1,…,6，k=1,…,10。例如，1min时[其中，i为列数（浓度），j为行数（重复），k=1]，表C.1的数据转化成表C.2的数据。表C.2t=1min与t=0min时NADH荧光强度的比值C.3数据拟合每列（NP浓度）的测量值随时间的函数可以通过变点回归来拟合，即两个独立的线性回归：一个GB/TXXXXX—XXXX/ISO20814:2019是将数据拟合到转变点，另一个是在转变点之后拟合。前一个回归线的斜率是一个重要参数。当测量时间tijk<转变时间tC时，pijk=(αi-β1i×tC)+β1i×tijkpijk=(αi-β2i×tC)+β2i×tijk=λ2i+β2i×0ijk。将前一个线性拟合的斜率（参见图C.1所示）除以第2列（仅含NADH）荧光下降的斜率，并乘以NADH浓度。由拟合获得的两个斜率（参见表C.3）的标准不确定度，通过不确定度传递可获得结果的标准不确定度。注：数据相对于t=0min时归一化。图C.1UV暴光1min后NADH荧光强度随时间的变化图表C.3NADH光氧化速率随TiO2NP浓度变化表NADH校准的斜率50GB/TXXXXX—XXXX/ISO20814:2019当浓度高于10μg/mL，下面的线性回归模型适用于每家实验室的数据：使用免费软件OpenBUGS通过马尔科夫链蒙特卡洛（BayesianMarkovChainMonteCarlo）方法进行拟合。标准不确定度是参数b后验概率分布的标准偏差。中位数的95%置信区间如表C.4所示，某些实验室的后验分布不对称。b不确定度的主要来源是拟合的不确定度，以及两个斜率比值的不确定度u1i。β19表C.4conci时的回归斜率评估NISTArizonaC.4结果6家实验室8次测量的平均斜率b及不确定度界限如图C.2所示。图C.295%不确定度界限的斜率b（NISTSRM1898TiO2NP的NADH等效比PCA）C.5认可值NISTSRM1898TiO2NP的NADH等效比PCA：b=(0.10±0.02)mmol∙min-1∙g-1。GB/TXXXXX—XXXX/ISO20814:2019通过随机效应元分析获得了参数b的认可值[8]，可使用NIST认可生成器（NICOB）[10-11]应用程序容易完成，下载网址：/。这样生成认可值0.10及标准不确定度0.02。NICOB还生成了±1标准不确定度的认可图，其中每家实验室斜率的±1标准不确定度如图C.3所示。当实验室间增加了不确定度分量时，不确定度也随之放大。说明：认可值μ和区间μ±u(μ)测量值xjxj±ujxj±(uj2+τ2)1/2图C.3具有标准不确定度界限的认可值bGB/TXXXXX—XXXX/ISO20814:2019参考文献[1]ISO10676,Fineceramics(advancedceramics,advancedtechnicalceramics)—Testmethodforwaterpurificationperformanceofsemiconductingphotocatalyticmaterialsbymeasurementofformingabilityofactiveoxygen[2]ISO10678,Fineceramics(advancedceramics,advancedtechnicalceramics)—Determinationofphotocatalyticactivityofsurfacesinanaqueousmediumbydegradationofmethyleneblue[3]ISO18153:2003,Invitrodiagnosticmedicaldevices—Measurementofquantitiesinbiologicalsamples—Metrologicaltraceabilityofvaluesforcatalyticconcentrationofenzymes