洋葱、大蒜病毒鉴定技术规程

1洋葱、大蒜病毒鉴定技术规程本文件规定了内蒙古洋葱、大蒜病毒鉴定技术的术语和定义，检测对象，取样部位，抽样，鉴定方法和判定规则。本文件适用于内蒙古洋葱、大蒜的病毒鉴定。环境相似的洋葱、大蒜产区可参照执行。2规范性引用文件本文件没有规范性引用文件。3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1洋葱Alliumcepa又称葱头、圆葱，百合科、葱属两年生园艺作物，以地下鳞茎为食用部位，具有强烈香气。3.2大蒜Alliumsativum百合科、葱属多年生园艺作物，繁殖殖方式为营养繁殖。3.3反转录-聚合酶链式反应Reversetranscription-polymerasechainreaction(RT-PCR)提取洋葱、大蒜检材的总RNA，以其中的mRNA为模板，利用反转录酶反转录成cDNA，再以cDNA为模板进行聚合酶链式反应。4检测对象4.1洋葱主要病毒a）洋葱黄矮病毒（onionyellowdwarfvirus，OYDV）b）韭葱黄条病毒（leekyellowstripevirus，LYSV）c）胡葱黄条病毒（shallotyellowstripevirus，SYSV）d)大蒜普通潜隐病毒（garliccommonlatentvirus，GCLV）f)鸢尾黄斑病毒(irisyellowspottospovirus，IYSV)g)番茄斑萎病毒(tomatospottedwilttospovirus，TSWV)h)黄瓜花叶病毒（cucumbermosaicvirus，CMV）4.2大蒜主要病毒a）洋葱黄矮病毒（onionyellowdwarfvirus，OYDV）2b）韭葱黄条病毒（leekyellowstripevirus，LYSV）c）胡葱黄条病毒（shallotyellowstripevirus，SYSV）d)大蒜普通潜隐病毒（garliccommonlatentvirus，GCLV）e）葱潜隐病毒（shallotlatentvirus，ShLV）f）鸢尾黄斑病毒(irisyellowspottospovirus，IYSV)g）番茄斑萎病毒(tomatospottedwilttospovirus，TSWV)h）大蒜黄花叶相关病毒(garlicyellowmosaic-associatedvirus，GYMaV）i）黄瓜花叶病毒（cucumbermosaicvirus，CMV）j）大蒜病毒A（garlicvirusA，GarV-A）k）大蒜病毒B（garlicvirusB，GarV-B）l）大蒜病毒C（garlicvirusC，GarV-C）m）大蒜病毒D（garlicvirusD，GarV-D）n）大蒜病毒E（garlicvirusE，GarV-E）o）大蒜病毒X（garlicvirusX，GarV-X）p）葱病毒X(shallotvirusX，ShV-X)q）紫云英矮缩病毒（milkvetchdwarfvirus，MDV）5取样5.1取样方法5.1.1五点取样法对于洋葱、大蒜无症状的种植区或面积较大的种植区采用5点取样法随机抽取。1000株以内抽检10株（含1000株）；1000株～10000株（含10000株）,首个1000株抽检10株之后每增加1000株增检5株，不足1000株按1000株计；超过10000株，第1000～10000株按上述方法抽样，之后每增加1000株增检20株，不足1000株按1000株计。5.1.2根据症状观测取样感染病毒病的洋葱、大蒜极易表现出矮化、扭曲、黄化、褪绿以及坏死斑等症状。根据在洋葱、大蒜上观测的各症状表现可进行有效取样。5.2取样部位洋葱、大蒜生长前期取幼嫩叶片放置自封袋，4℃保存不超过24h或液氮预冷后立即放置于-80℃长期保存备用；生长后期以娇嫩叶片及鳞茎为取样部位，较嫩叶片放置自封袋，立即进行液氮预冷并放置-80℃长期保存备用，鳞茎放置干燥、通风、无污染的收集盒中存放。6反转录-聚合酶链式反应法(RT-PCR法)鉴定详见附录A。7判定规则RT-PCR检测呈阳性反应的判定为携带病毒。脱毒洋葱、大蒜带毒率为0。反转录-聚合酶链式反应法(RT-PCR法)鉴定A.1试剂盒A.1.1植物DNA、RNA提取试剂盒：选择适合提取含有多糖多酚材料的DNA、RNA试剂盒。B.1.2反转录试剂盒：使用市售的商品反转录试剂盒，按照说明进行操作。B.1.3PCR扩增试剂盒：使用市售的商品PCR扩增试剂盒，按照说明进行操作。A.2引物侵染洋葱、大蒜的各病毒PCR检测特异性引物见表A.1表A.1洋葱、大蒜各病毒的特异性引物℃bpACTGAAATGCGCCATTATYT4CGGATCCTTAGAATGTTATAATACTAAGCCCCGCCCCAGCTCA.3操作步骤A.3.1洋葱、大蒜各病毒DNA或RNA提取A.3.1.1提取方法按照试剂盒操作说明书提取。A.3.1.2判定规则提取的RNA质量判定参照DB6111/T172—2021执行。DNA判定采用电泳法检测，检测结果应有1条清晰明亮的条带；微量分光光度计测得OD260/OD280比值1.8以上，以此为模板直接进行反转录或置于-80℃条件下保存。不符合以上指标的需重新提取。A.3.2反转录按照试剂盒操作说明书对提取的RNA进行反转录。A.3.3病毒检测A.3.3.1PCR扩增A.3.3.1.1PCR的反应体系5按说明书指定的剂量在PCR反应管中依次加入多聚酶,病毒特异性检测上下游引物，cDNA模板或提取的样本DNA,无菌蒸馏水。目标病毒对应检测引物见表A.1。A.3.3.1.2PCR反应程序将PCR管放入PCR仪中,按说明书指定程序进行聚合酶链式反应，待测病毒引物退火温度按指定值进行输入，延伸时长可根据片段大小适当调整，反应产物采用凝胶电泳法进行检测。A.3.3.2电泳检测制备1%的琼脂糖凝胶,每个泳道加入5μL的PCR产物，110V恒压电泳25min。A.3.3.3凝胶成像分析电泳结束后，将琼脂糖凝胶置于凝胶成像仪上成像，根据DNA分子量标记判断扩增出的目的条带大小是否符合目