马铃薯抗黑胫病鉴定评价技术规程

1马铃薯抗黑胫病鉴定评价技术规程本文件规定了马铃薯抗黑胫病的鉴定的术语和定义、培养基、接种体制备、接种、病情调查和抗病性评价等内容。本文件适用于内蒙古地区马铃薯品种在室内条件下对黑胫病抗性水平的鉴定。2规范性引用文件本文件没有规范性引用文件。3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1马铃薯黑胫病Potatoblackleg马铃薯黑胫病是由果胶杆菌属（Pectobacteriumsp.）、欧文氏菌(Erwiniacarotovora)引起的细菌性病害。病原菌可以通过伤口直接侵染，还可以通过灌水、昆虫、土壤等传播。感病植株的茎基变黑，严重时呈水渍状腐烂，逐渐扩展到茎上部，引起叶片出现卷曲皱缩、褪绿黄化等现象，最终茎秆腐烂，植株全部枯死。4培养基LBA培养基：5g酵母提取物，10g胰蛋白胨，10gNaCl，15g琼脂粉，1000mL去离子水,121℃灭菌15min。LB液体培养基：不加琼脂粉，其余同LBA5接种体制备5.1病原物分离从发病马铃薯植株的发病部位采用组织分离结合单菌落分离病原物，分离物经形态学、生理生化特性和分子序列鉴定为马铃薯黑胫病病原菌，经柯赫氏法则验证其致病性后保存备用。5.2菌悬液的配置取100μl在-80℃保存的分离病原菌涂抹于LBA固体培养基上，28℃复壮48h。挑取菌落于100mLLB液体培养基中，28℃、180r/min培养48h，用平板计数法调节菌悬液浓度至106cfu/mL。6接种6.1温室盆栽茎杆注射接种法26.1.1马铃薯准备每个马铃薯品种选择形态完好、无明显伤病的马铃薯种薯种植在容积4L、装有无菌的细沙与腐殖土等量混匀的盆中，16h光照/8h黑暗条件下培养，湿度在70%，温度控制在25℃。采用随机区组排列盆栽，待马铃薯植株长出高约7~8cm用于接种。6.1.2接种用无菌牙签戳伤植株的茎基部，移液枪吸取10μL106cfu/mL的菌悬液，注射于马铃薯植株茎基部，以接种等量LB培养基的处理作为对照，接种后将植株置于适宜的温度（25-28℃)和湿度（90%以上）环境条件下培养。6.2离体薯块接种法6.2.1接种体制备选取无伤病的各品种马铃薯于1%的次氯酸钠溶液浸泡5min进行消毒，无菌水清洗3次后晾干备用。6.2.2接种在每个马铃薯中央打一个4mm直径×2mm深的圆孔，加入10μl菌悬液，置于铺有灭菌纱布的盆中保湿，25℃的培养箱中暗培养。每个品种设置3次重复，接种等剂量的无菌水作为对照。7病情调查观察发病情况，温室盆栽茎杆注射接种法测量发病马铃薯茎基部的病斑直径，以接种点为中心测定上下各5cm范围内的发病面积占调查面积的比率进行分级和抗性评价。调查离体薯块接种36h后的发病情况，测量腐烂区域的病斑直径，沿接种点纵切，测量薯块纵切面接种点以下腐烂区域的深度和宽度（mm），以其乘积的值的平均数代表腐烂区域的切面面积，切片面积/100得到腐烂程度（cm2）。——调查范围内无病状发生，抗病等级为0；——发病面积占调查面积25%以下，抗病等级为1级；——发病面积占调查面积25%～50%，抗病等级为2级；——发病面积占调查面积50%～75%级，抗病等级为3级；——发病面积占调查面积75%～100%级，抗病等级为4。8抗病性评价计算抗病等级平均值，以抗病等级平均值评价抗病性：发病面积为0～1