基因编辑技术及相关IVD产品简介

基因编辑技术及相关IVD产品简介（原创2021-10-14CMDE中国器审）

基因编辑技术通常指的是利用基因编辑系统进行分子生物学操作的技术。这里的基因编辑系统是一大类序列依赖的基因剪切酶的统称，最广泛使用为CRISPR/Cas系统，其中CRISPR全称clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats,意为“成簇的规律间隔的短回文重复序列”；Cas指的是CRISPR-associated,意为“与CRISPR相关的（蛋白）”，可以理解为与CRISPR相关的具备某种或某些（剪切）酶活性的蛋白。由于这个系统包含CRISPR相关的剪切蛋白，因此实现了基因的剪切-拼接，达到“编辑”的功能，因此，CRISPR也成为了基因编辑技术的代名词。

基因编辑的现象最早发现于原核生物（细菌和古生菌）中，是细菌抵抗病毒的自适应免疫系统。简要来说，其原理是细菌首次被病毒入侵时，其基因组序列整合了病毒的基因组形成了一段CRISPR，当再有外源性的病毒（质粒或噬菌体）入侵时，该段CRISPR可以识别再次入侵的外源DNA，细菌利用其自身的Cas相关蛋白切断外源的基因组变为线性，使得病毒无法进行复制和表达，最终被细菌体内的酶降解。

基因编辑系统中的CRISPR/Cas系统能够“识别序列”并“剪切”的特性使得其成为基因编辑领域的良好工具，目前已发现并研究了多种CRISPR/Cas系统，包括CRISPR/Cas9，CRISPR/Cas12a，CRISPR/Cas13a等。特别是近几年发现的Cas13a，Cas12a等，他们一方面具有识别并剪切目标基因的特性，还具有无差别剪切DNA/RNA的特性。根据无差别剪切DNA/RNA的特性，研究人员将DNA/RNA设计成标记有荧光报告基因和猝灭基因的报告基团，当用CRISPR/Cas12a或CRISPR/Cas13a识别目标基因并剪切目标基因时，同时剪切下来荧光报告基因，其释放的荧光数和靶基因数量一致，这样可以通过荧光检测设备检测的荧光数量来间接检测靶基因。该项检测通过等温扩增及荧光阅读仪等常规仪器即可完成，在遵循实验室生物安全管理相关规定的前提下，应用场景广泛。

目前已有多种有关IVD检测应用研究的文章发表，总结来说，这类发表的方法通常先从人体样本中提取目标核酸（如病毒的DNA或RNA），Cas经过一段先导RNA（gRNA,guideRNA）的设计引导其配对至目标核酸序列位置，通过RPA（RecombinasePolymeraseAmplification，重组酶聚合酶扩增）扩增（一种等温扩增技术，最佳反应温度37℃）放大其中目标基因的浓度，随后采用基因编辑技术进行剪切并释放荧光信号，进而对荧光信号进行检测。例一，采用CRISPR/Cas12a识别单链DNA开发的检测人体样本中人乳头瘤病毒HPV16和18的试剂，也叫做DETECTR（DNAendonuclease-targetedCRISPRtransreporter）；例二，国外的张峰团队结合前期研究开发了SHERLOCK（specifichigh-sensitivityenzymaticreporterunlocking）方法，该方法基于Cas13a酶，采用RPA扩增技术和RNA引导Cas13a进行信号剪切，该技术荧光信号是连接在RNA上的，利用Cas13酶的附带的无差别剪切RNA的功能，实现信号释放，该团队认为开发产品的难点在于提取纯化Cas13；例三，其他团队采用另外一种更简便快速的样本处理方式HUDSON(heatingunextracteddiagnosticsamplestoobliteratenucleases）处理诸如咽拭子、唾液、尿液等样本并结合SHERLOCK方法，已证实可以很好地检出如寨卡病毒、登革病毒、黄病毒等RNA病毒，由于HUDSON仅是通过加热免提取处理临床唾液或尿液样本，抛开了繁复的核酸提取过程，今后有望应用于POCT现场检测，或可供WHO采购用在实验条件有限的国家和地区；例四，还有团队开发了用于人基因组单核苷酸多态性（SNP，singlenucleotidepolymorphism）的检测方法等。

新冠病毒同属于RNA病毒，自去年疫情爆发以来，FDA在2020年5月EUA（forEmergencyUseAuthorizationonly，仅限于紧急授权使用）首次批准了张峰团队开发的基因编辑IVD产品——SHERLOCK方法学定性检测人体上呼吸道样本中的新冠病毒N基因和ORF1ab基因，从检索批准文件和产品说明书上看，该产品是一个仅限在实验室使用而非可以广泛使用的产品，需要采用Thermo公司的RNA提取试剂盒严格地进行核酸提取纯化步骤来完成，并非如文献报道的那样采用加热免提取来处理临床样本如唾液、咽拭子等。分析性能方面，该产品最低检出限N基因为1.35copies/ulVTM，ORF1ab基因为6.75copies/ulVTM，整个从提取至检测出结果时间不超过2小时。

国内目前已有进入优先/应急审评的国产基因编辑方法学的新冠病毒检测产品中，已批准的产品2个，处于沟通交流及资料完善中的产品1个，从现有资料看，采用的基因编辑系统一种为国内厂商使用的CRISPR/Cas13a以及Cas12a系统，与国际研究相符，因为Cas13或Cas12除了靶向剪切目标核酸序列外，还附带有无差别剪切核酸信号的功能。另外，国内厂商都是通过外购获得Cas13a和Cas12a这两种剪切蛋白，并未具有自行制备的能力。第二种为有自己自主知识产权的科研院所和企业合作，转化为相应基因编辑方法学的新冠病毒检测产品，比如中国科学院动物研究所周琪院士团队，其研究者采用的是CRISPR/Cas12b剪切系统，该系统是我国自主研发并申请了国际、国内专利，目前产品已完成注册检验，处于沟通交流及资料完善阶段。目前国产产品从批准和完成的注册检验的情况来看，可以满足新冠病毒国家参考品和临床使用的要求，根据产品不同，最低检出限在450copies～1000copies左右。

从CRISPR/Cas系统的发现到临床实践的应用及探索，除了最初带给人类上帝之手的惊喜之外，研究人员逐渐认识到了该系统家族应用的优、缺点，目前仍在不断地进行改造和应用于不同的领域，随着近年Cas13及Cas12的发现，相较早先的Cas9基因编辑系统具有更好的准确性，解决了脱靶效应（即未严格按照设计要求剪切）问题，同时其附带的无差别剪切功能契合了体外诊断中需要释放检测信号的需求，总体来说CRISPR应用到IVD是一个划时代的发现，可以称作是新的诊断技术，其精准性和快速性逐渐得到了科研人员的认可。

准确、快速、简便、经济一直是IVD开发的目标，但就目前已在临床应用的产品来看，CRISPR技术和传统的成熟PCR相比还未显现明显优势，PCR的最低检出限和检测速度甚至可以超越CRISPR。一个新技术需要一定时间的成熟和发展，也需要越来越多的临床应用反馈来改进，因此，随着提取技术、等温扩增技术的应用以及更新更好的Cas蛋白的发现，CRISPR技术是否能超越传统PCR，是否如发表文献所说的有专属的应用场景还有待观察。

审评关注点：gRNA设计，靶序列的识别信号剪切的验证与对应关系，脱靶效应，最低检出限，检测所需时间等。

注：

1.基因编辑诊断产品的扩增方式多采用等温扩增，除采用RPA外，还常采用LAMP（Loop-mediatedisothermalamplification，环介导等温扩增）和RAA（RecombinaseAidedAmplification，重组酶介导等温扩增）。

2.有报道Cas12a的无差别剪切活性激活在gRNA与靶序列配对时就发生了，并不依赖与靶序列是否切割。

参考文献：

[1]Kellner,M.J.,Koob,J.G.,Gootenberg,J.S.etal.SHERLOCK:nucleicaciddetectionwithCRISPRnucleases.NatureProtocal14,2986–3012(2019).

/10.1038/s41596-019-0210-2

[2]DanielS.Chertow,Next-generationdiagnosticswithCRISPR,Science360(6387),381-382,2018

[3]LuciaAC,FedericoPB,GuillermoDR,JessicaVF,CRISPR-basedplatformforcarbapenemasesandemergingvirusesdetectionusingCas12a(Cpf1)effectornuclease,EmergingMicrobesandinfections,June2020

[4]FDA网站EUA查询：产品名称：SherlockCRISPRSARS-CoV-2Kit,2020May6，/medical-devices/coronavirus-disease-2019-covid-19-emergency-use-authorizations-medical-devices/vitro-diagnostics-euas

[5]SHERLOCK官网产品说明书：https://sherlock.bio/wp-content/uploads/2020/06/EUA200466-Sherlock-IFU-_FDA-Authorized-Copy_-05062020-FINAL-Copy3.pdf

[6]LuGuo,XuehanSun,XingeWang,ChenLiang,HaipingJiang,QingqinGao,MoyuDai,BinQu,SenFang,YihuanMao,YangcanChen,GuihaiFeng,QiGu,RuiqiRachelWang,QiZhouandWeiLi，SARS-CoV-2detectionwithCRISPRdiagnostics，CellDiscoverry(2020)