高等分子生物学-研究生

1.简述加工基本步骤(P110-113)A.5'端加帽：pppNp-(前体5'端)磷酸酶催化水解ppNp-鸟甘酸转移酶GpppNp-甲基转移酶m7GpppmNp-（0型帽子结构）；B.3'端加poly(A)尾：C.剪接：除去内含子序列，并将外显子序列连接成为成熟的有功能的mRNA分子；D.mRNA前体化学修饰：主要是甲基化；E.mRNA前体编辑：有一些基因编码序列与mRNA的相应序列有差异，转录产物上需要插入，删除或取代一些核苷酸才能生成有翻译功能的mRNA分子。2.简述与糖尿病发病有关基因的改变（P157-159）A.胰岛素(IDDM2)基因：a.IDDM2基因位于第11号染色体短臂15区带，由3个外显子（外显子Ⅱ编码A链和C肽、外显子Ⅲ编码C肽和B链）和2个内含子组成；b.共有5个位点改变可导致糖尿病。B.胰岛素受体(IDSR)基因：a.IDSR基因位于第19条染色体短臂远端p3.2～3.3区带、由22个外显子（外显子1～12编码受体α亚单位；外显子13～22编码β亚基）和21个内含子组成；b.自身磷酸化致使其构型转变，激活其他底物的受体使底物磷酸化，通过信号传导调节代谢酶活性以及基因表达的改变；c.IDSR受体遗传性缺陷时、发生严重胰岛素抵抗、影响了受体的生物合成和生化性状。C.葡萄糖激酶(GCK)基因：a.GCK基因位于第7条染色体短臂上、由10个外显子组成；b.具有组织特异性、在胰岛β细胞和肝细胞中表达；c.GCK基因的突变大多数为错义突变，使分子氨基酸序列改变，降低酶的活性，是少年起病成年型糖尿病（MODY）的分子机制。D.糖原合酶（GSY）基因：a.GSY位于19号染色体载脂蛋白C-Ⅱ及富含组氨酸的钙结合蛋白基因之间，拥有10个等位基因；b.是保持体内血糖平衡的通路之一，在周围组织对葡萄糖的非氧化性摄取，即向糖原合成的转化中起着重要作用；c.该通路的损害、可引起周围组织对胰岛素的抵抗、常伴有高血压和明显的家族遗传倾向。E.线粒体tRNA基因：当线粒体核苷酸3243位由Ａ突变为Ｇ，就会引发线粒体基因突变糖尿病，是人类少数已知的单基因突变糖尿病中最为多见的一种。F.其他基因：激素原转换酶（PC）基因，胰岛素受体作用底物-1（IRS-1）基因，载脂蛋白（Apo）基因群。3.简述与高血压主要基因的变化（P162）A.肾素-血管紧张素系统（RAS）:a.由肾素、血管紧张素原（AGT）、血管紧张素转化酶(ACE)、血管紧张素(Ang)及其相应的受体构成；b.AGT基因定位于染色体1q42-43、含有5个外显子和4个内含子。约有15种不同的突变体。其中以T173M和M235T两种突变体最为重要，M235T突变体（TT）即基因突变导致AGT第235号氨基酸由甲硫氨酸转变为苏氨酸；c.ACE基因定位染色体17q23、含有26个外显子和25个内含子、在16号内含子内存在插入（I）和缺失（D）两种变异体，ACE活性增加、血管紧张素Ⅱ含量增加、促进血管收缩、增强心肌收缩力和水盐代谢作用（钠潴留），参与高血压形成。B.心纳素（ANP）：a.又称心房利纳因子（心房肽），一种内分泌激素。存在于心房肌细胞内的颗粒中，调节机体水平衡和影响血压；b.生物学作用：利钠利尿：通过增加肾小球滤过率、增加肾髓质的血流量及抑制近曲小管和集合管对钠的重吸收，产生利尿利钠作用，具有快、短、强的特点。抑制肾素－血管紧张素－醛固酮系统：能抑制肾近球旁细胞释放肾素，并通过对肾素－血管紧张系统的抑制以及对肾上腺皮质的直接作用，抑制醛固酮的分泌，这可能与钙和磷脂酶A有关。舒张血管、降低血压、改善心功能的作用：其血管舒张作用与钙离子内流有关。松弛平滑肌，减少抗利尿激素的释放。c.有三种受体：NPRA、NPRB和NPRC、A和B受体是鸟苷酸环化酶介导的、主要发挥利钠、利尿和血管舒张作用；C型是非鸟苷酸环化酶介导、参与ANP的内趋化和清除作用。C.内皮素(ET)系统:a.不仅存在于血管内皮，也广泛存在于各种组织和细胞中，是调节心血管功能的重要因子，对维持基础血管张力与心血管系统稳态起重要作用。b.主要有ET-1，ET-2，ET-3三个主要成员，其差别在于个别氨基酸的残基，对于心血管起主要作用的是ET-1。c.ET-1基因C19BT突变型的个体,编码氨基酸由精氨酸（Lys）突变为天冬酰胺(Asn),易患体重过重性高血压，ET-1A型受体第323位密码子由C突变为T易患高血压。D.NOS和激肽释放酶：a.原发性高血压患者表现内皮细胞合成或释放NO不足、其原因是NO合酶活性受抑制。内皮源性舒张因子（EDRF）合成释放不足，血管内皮依赖的舒张功能降低；血管对加压物质的反应性增高。b.高血压病人内皮细胞释放NO减少的原因：底物左旋精氨酸缺乏；NO合成酶活性受抑制；氧自由基释放增多。4.简述AD发病的基因的变化（P163-164）A.AD与三种基因的突变有关，分别是位于第21号染色体上的β淀粉样前体蛋白(APP)编码的基因，14号染色体上的早衰基因(PSEN1)和1号染色体上的早衰基因(PSEN2)、19号染色体上的apoE的E4等位基因。

B.β淀粉样前体蛋白(APP）基因:a.位于21q21.2，至少由18个外显子组成。b.正常情况下，APP由β分泌酶裂解为可溶性Aβ，基因突变或其他因素可以导致APP氨基酸序列或裂解部位的改变、从而产生易于沉淀的Aβ。沉淀的Aβ聚合物对神经元具有毒性作用、可导致神经元的退行性病变。C.早老素（PS）基因：a.PS-1基因定位于14号染色体上，有10个外显子（编号外显子3-12）与早发AD有关，PS-2基因定位于１号染色体上，基因突变家族的AD发病较晚。。b.PS-1基因的突变包括错义和剪接位点突变，通过干扰细胞钙自稳而使神经细胞对凋亡的易感性增加，引起Tau蛋白等细胞骨架蛋白质之间的相互作用异常，破坏离子通道的微结构，影响细胞内外钙离子的交换等，进一步引起AD的病理改变。D.载脂蛋白E（ApoE）基因：a.ApoE是血浆中主要的载脂蛋白之一，也是脑中主要的胆固醇载体蛋白。在人类，主要有3个apoE的等位基因。ε2,ε3,ε4。Apoε2、Apoε3有助于维护Tau蛋白(一种细胞骨架相关蛋白质)的稳定性，对AD的发生有抑制作用。b.位于第19号染色体的Apoε4可与β-淀粉样蛋白(Aβ)呈特异性、高亲和力结合，影响星型细胞和神经元对Aβ的清除，Aβ沉积，加速老年斑的形成。E.与AD相关的递质改变:有乙酰胆碱系统、单胺系统、氨基酸类和神经肽递质，其中胆碱乙酰转移酶和乙酰胆碱类递质的减少是AD的重要原因5.简述HIV病毒与艾滋病发病(P165-166)A.HIV结构：B.HIV进入细胞：a.分子中gp120与CD4+T细胞的CD4+高度亲和力、由gp41介导病毒包膜与细胞膜融合、使HIV的基因组和相关病毒进入细胞膜。b.外膜蛋白gp120与T淋巴细胞表面CD4受体蛋白结合后，gp120构象发生改变，gp120与gp41分离；c.暴露出的gp41可以插入T淋巴细胞膜造成膜融合，致使病毒核心导入细胞。接着HIV丢掉外壳蛋白。C.HIV的复制和释放:RNA→cDNA→进入细胞核形成环状DNA→整合进染色体DNA→原病毒→转录成mRNA→子代病毒RNA→组装成病毒颗粒→病毒释放→子代病毒D.HIV的致病机制：HIV选择性的侵犯带有CD4分子的，主要有T4淋巴细胞、单核-巨噬细胞、树突状细胞等。细胞表面CD4分子是HIV受体，通过HIV囊膜蛋白gp120与细胞膜上CD4结合后由gp41介导使毒穿入易感细胞内，大量的病毒芽生破坏细胞膜、直接介导细胞溶解效应、从而干扰细胞功能，导致宿主免疫功能全面障碍从而发生AIDS。6.简述朊病毒结构与发病关系(P166-168)A.阮病毒(PrP):无核酸,仅有可遗传的蛋白质的一类超微生物，构成朊病毒的蛋白质有两种形式。一种是正常的细胞型（PrPc），属蛋白酶敏感型，即容易被蛋白酶分解；另一种是异常的致病型（PrPSc），具有一定的抗蛋白酶消化特性。B.细胞型（正常型PrPc）和搔痒型（致病型PrPsc）：两者蛋白质一级结构完全相同,其共价键也无变化,差异在三级结构。主要表现螺旋和折叠的含量不同，PrPc显示α-螺旋结构，PrPSc显示β-折叠结构；PrPc分布于脑等组织细胞表面,而PrPsc则存在于细胞内次极溶酶体内。C.朊病毒与疾病：a.Prion病是一种人和动物的致死性中枢神经系统慢性退行性疾病、这类疾病的共同特征是：潜伏期长，一旦发病即呈慢性退行性发展，最终死亡。b.大量PrPSC聚合和沉积→神经细胞空泡变性→海绵状脑病(主要临床表现:痴呆、共济失调、震颤等)c.Prion病主要有人的库鲁病和克雅氏症，动物的羊瘙痒病，牛海绵状脑病7.简述基因突变方式与发病(P150-151)A.DNA的变异类型:a.错义突变：碱基对的改变引起某种氨基酸的密码子改变；b.无义突变：某个碱基的序列改变使密码子转变为终止密码子；c.同义突变：碱基改变不影响氨基酸密码子的改变称为同义突变。这是密码子的简并性决定、因为密码子第三个碱基可以改变；d.移码突变：DNA编码序列中插入（增加）或缺失一个或几个碱基，其下游阅读框发生改变，导致氨基酸顺序及蛋白质异常或无活性；e.动态突变：邻近基因或位于基因序列中的三核苷酸重复拷贝数,在一代代传递过程中会发生明显的增加，如(CGG)n、(CAG)n等，从而使（导致）某些遗传病的发病；B.单核苷酸多态性(SNPs):a.SNPs指基因组序列中单核苷酸改变时发生的DNA序列的变化,是等位基因的变异、所以被认为是造成遗传性疾病的原因。b.SNPs实际上是碱基突变引起核苷酸改变、常见于点突变中的转换、大多数是GC序列的变化、因为胞嘧啶甲基化、自发脱氨转变为胸腺嘧啶、使C→T。8.叙述癌基因与抑癌基因差异？（P546）A.在功能上，抑癌基因起负调控，原癌基因起正调控；B.在遗传方式上，原癌基因是显性的，抑癌基因是隐性的；C.在突变发生的细胞类型上，抑癌基因突变可发生在体细胞中，也可发生在生殖细胞中并通过生殖细胞得到遗传，原癌基因突变只能发生在体细胞中；D.数量上，原癌基因多于抑癌基因。E.在等位基因上，癌基因只要一个等位基因发生突变时就可以引起癌变，而抑癌基因只要有一个等位基因是野生型时，就可以抑制癌变。9.简述载体的概念、载体的条件、质粒结构的特征？(P173-174)A.载体：是指可以携带目的基因进入宿主细胞的运载工具。B.载体的条件：a.具有自主复制能力，以保证重组DNA分子可以在宿主细胞内得到扩增；b.具有较多的拷贝数，易与宿主细胞的染色体DNA分开，便于分离提纯；c.分子量相对较小，易于操作，并有足够的接纳目的基因的容量；d.在非宿主功能必须的DNA区段有较多的单一限制性核酸内切酶位点用于目的基因的克隆；e.有一个或多个筛选标记；f.具有较高的遗传稳定性。C.质粒结构特征：a.pBR322:是经典环状双链DNA质粒载体的代表，较小的分子量（4.36kb）；拷贝数高便于制备；有数个限制性内切酶的单一酶切位点，用于插入外源DNA片段；有两个抗药性基因标记（四环素和氨苄青霉素）；标记基因均有外源DNA克隆位点；有复制起始点（Ori），保证高拷贝，自我复制。b.pUC18和pUC19（pUC18/19）：分子量小（2.69kb）；有复制起始点；含有氨苄青霉素抗性基因、大肠杆菌β-半乳糖苷酶基因（LacZ基因）启动子及编码其α-肽的序列；含有一个多克隆位点（MCS）；拷贝数多；易于检测重组。10.简述限制性内切酶、klenow聚合酶、TaqDNA聚合酶、修饰酶作用（P176-178）A.限制性内切酶:与甲基化酶共同构成细菌的限制修饰体系，以限制外源DNA，保护自身DNA，对细菌性状的稳定遗传具有重要意义。B.klenow聚合酶（大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的klenow片段）：具有5'→3'聚合酶和3'→5'外切酶活性，失去了5'→3'外切酶活性。主要用于填补经限制性内切酶消化形成的DNA3'末端、cDNA合成中的第二链合成和DNA序列测定。C.TaqDNA聚合酶（热稳定DNA聚合酶）：具有5'→3'聚合酶和5'→3'外切酶活性，失去了3'→5'外切酶活性，错配率高。主要用于聚合酶链反应（PCR)。D.修饰酶:对DNA或RNA进行修饰，以有利于克隆的进行。11.简述重组DNA技术的基本步骤（P172）A.获取目的基因；B.将目的基因进行必要的改造；C.选择和修饰克隆载体；D.将目的基因与载体连接，获得含有目的基因的重组载体；E.重组载体导入宿主细胞；F.筛选出含重组DNA的细胞。12.简述目的基因概念及目的基因获取方法（P178）A.目的基因：指待测或待研究的特定基因，亦称供体基因。B.目的基因的获得：a.直接从染色体中分离：适用于基因结构简单的原核生物中的多拷贝基因。b.化学合成法：适用于已知分子量很小的多肽编码基因。c.用反转录酶合成cDNA：从细胞中提取mRNA为模板，反转录生成cDNA，然后进行基因克隆，从而获得某种特定基因。d.从基因组文库及cDNA文库中筛选获得：常用方法。e.聚合酶链反应：主要方法。13.简述聚合酶链反应（PCR）原理及基本步骤（P185）A.PCR原理：以拟扩增的DNA分子为模板，以一对分别与模板5'末端和3'末端相互补的寡核苷酸片段为引物，在DNA聚合酶的作用下，按照半保留复制的机制沿着模板链延伸直至完成新的DNA合成，反复重复这一过程，即可使目的DNA片段得到扩增。B.基本步骤：a.变性：待扩增的DNA模板在反应体系中加热（95℃）变性、双链DNA变性成两条单链；b.退火：降低温度（55~60℃）、使引物与两条单链模板DNA发生退火作用、并结合在靶DNA区段两端的互补序列位置上。c.延伸：反应体系温度（72℃）升高，在TaqDNA聚合酶的作用下，从引物的3'端加入脱氧核苷三磷酸(dNTP)，并沿着模板按5'→3'方向延伸，合成新生DNA互补链。经多次循环（25～30次）后即可达到扩增DNA片段的目的。14.简述双脱氧终止法（Sanger法）的基本原理及操作步骤（P190）A.基本原理：利用四种2'，3'-双脱氧核苷酸（ddNTP）代替部分脱氧核苷酸（dNTP）作为底物进行DNA合成反应。一旦2'，3'-双脱氧核苷酸参入道合成DNA链中，由于核糖的3'位碳原子上不含羟基，不能与下一个核苷酸反应形成磷酸二酯键，因此合成反应终止。B.操作步骤：首先将模板分为四组，分别加入引物启动DNA的合成，用32P或35S标记的dNTP作为底物掺入道新合成的DNA链中；反应一段时间后，每组内加入四种ddNTP的一种，获得在不同部位终止反应的大小不同的DNA链；经聚丙烯酰胺凝胶电泳分离这些片段，通过放射自显影读出DNA序列。15.简述探针的概念及探针具备条件（P192）A.概念：在核酸杂交反应中，一个序列与待测序列互补的DNA片段。B.条件：有标记物，便于分析杂交体；单链核酸；高度特异性，只与待测核酸杂交；通常是基因编码序列；标记灵敏度高而稳定。16.简述三种印迹法的基本步骤及不同点？（P193-194）A.基本步骤：样品制备；电泳分离；转移；杂交；检测。B.三种印迹法的不同点：DNA印迹技术（Southern）RNA印迹技术（Northern）蛋白质印迹技术（Western）靶核酸DNARNA蛋白质变性电泳后碱变性，电泳时不变性电泳前加热变性，电泳时加变性剂保持变性状态转移转膜前需碱变性以及中和处理转膜前不需变性和中和处理只有靠电转移方可完成限制性内切酶需要不需要不需要探针同位素标记的探针合成的寡核苷酸片段、克隆的或提取的DNA片段抗体17.简述基因操作的理论和技术准备？20世纪40年代，Avery发现了生物遗传物质化学本质是DNA；20世纪50年代，Watson-crack提出了DNA结构为双螺旋结构模型，搞清楚了生物遗传物质的分子机制；20世纪60年代，确定了遗传信息的传递方式：DNA→RNA→蛋白质，破译了全部遗传密码。18.简述Sourther印迹法的基本步骤(P193)A.待测核酸样品的制备:内切酶切割，产生大小不同的DNA片段；B.电泳分离：用琼脂糖凝胶电泳对DNA片段按分子量大小分离；电泳后用碱（NaOH）使DNA变性断裂为较短的单链DNA，再用中性缓冲液再中和；C.转膜：中和的DNA再转移到适当的固相支持物（NC膜）上并与之结合；D.杂交与洗膜：E.检测：放射自显影检测、比色或化学发光检测。19.比较两种文库的制备不同点？（P195-196）基因组文库（G-文库）cDNA文库（c-文库）获取目的基因方式限制性内切酶法逆转录法克隆包含信息基因组全部基因信息细胞全部mRNA片段大小大小内含子有无目的基因DNAmRNA20.简述鸟甘酸结合蛋白（G蛋白）结构及转导(cAMP-蛋白激酶A通路)中作用（P387）A.G蛋白循环：GTP-αβγ中的α亚基可于GTP结合，形成α-GTP并解离βγ；而GTP酶又可水解α-GTP，产生的游离α亚基即与βγ形成GTP-αβγ。B.结构：G蛋白是αβγ三个亚单位组成的异构三聚体，其中Gα是最重要的一种，称功能性亚单位，Gβ、Gγ可协调细胞反应。C.作用：a对糖代谢的调节：使糖原合酶磷酸化，抵制糖原合成；使糖原磷酸化酶b转化为有活性的糖原磷酸化酶a，促进糖原分解。b.对基因表达的调节：当蛋白激酶A（PKA）的催化亚基进入细胞核后，可催化反式作用因子CREB(cAMP应答原件结合蛋白)中特定的丝氨酸/苏氨酸残基磷酸化，磷酸化的CREB形成同源二聚体，与DNA上CRE（cAMP应答元件）结合，从而激活基因转录。21.简述G蛋白介导的第二信使转导通路（Ca2+-磷脂依赖性蛋白激酶通路）（P417-418）A.组成要素：胞外信息分子及其受体，G蛋白及磷脂酶，甘油二酯和蛋白激酶C，IP3（三磷酸肌醇）及其受体，Ca2+，CaM（钙调蛋白），依赖CaM的蛋白激酶；B.过程：a.胞外信息分子与受体结合后，引起受体构象改变，活化的受体催化G蛋白（Gp）的GDP与GTP交换，释放出α-GTP激活磷脂酶Cβ（PLCβ），PLCβ与PLCγ特异性地水解磷脂酰肌醇4,5-二磷酸（PIP2）而生成二酯酰甘油（DAG）和IP3；b.DAG在磷脂酰丝氨酸（PS）和Ca2+的配合下激活蛋白激酶C（PKC），使目标蛋白磷酸化而发生效应；c.IP3与其受体结合，使胞浆内的Ca2+浓度升高，Ca2+可与CaM结合激活Ca2+-CaM依赖的蛋白激酶，使目标蛋白磷酸化而发生效应。22.简述RAS-MAPK通路（P420-421）A.基本元素：催化性受体，衔接蛋白（Grb2），鸟苷酸释放因子（SOS），Ras蛋白（小G蛋白），丝裂原激活蛋白激酶（MAPK）系统，Raf(又称MAPK激酶激活因子，MAPKKK)；B.过程：信号（配体）→酪氨酸蛋白激酶（RTK）受体→受体二聚化→受体的自身磷酸化→活化RTK→Grb2→SOS增高→活化Ras蛋白→活化Raf→激活MAPKK(又称MEK)→MAPK（又称细胞外信号调节激酶，ERKs）磷酸化活化→转录因子磷酸化→激活靶基因→产生细胞应答和效应。23.简述cGMP-PKG通路(P419)A.激活cGMP-依赖性蛋白激酶（PKG）；B.当cGMP浓度增高时，它可交叉激活蛋白激酶A（PKA）；C.结合特异的激活和抑制磷酸二酯酶（PDE）家族，引起PKA活性的改变；D.在一些组织中，通过直接的别构效应调节离子通道。24.简述PI-3K-PKB（磷脂酰肌醇-3激酶-蛋白激酶B）通路(P425-426)A.细胞受到生长因子的刺激后，PI-3K产生PIP3，其能使PKB获得催化活性并转位于细胞膜上；B.在在细胞膜上的磷酸肌醇依赖性激酶-1（PDK1）催化下，PKB发生自身磷酸化从而完全活化；C.活化的PKB可调节基因的表达，抑制凋亡和调节细胞周期。25.简述受体类型，G蛋白偶联受体（P400-403）A受体类型：a.膜受体：配体依赖性离子通道受体(ICR)、G蛋白偶联受体（GPCR）、酶偶联受体（STMR）；b.胞内受体：胞浆受体、核内受体。B.G蛋白偶联受体（七跨膜受体）：a.组成：一条多肽链组成，N端在胞外，C端在胞内；b.结构:胞外区与配体结合，跨膜区为α-螺旋结构，胞内区第三个环的C端参与了受体与G蛋白的相互作用。26.简述信号转导的开关分子对通路作用（P379）A.分子开关：是指通过激活机制或失活机制精确控制细胞内一系列信号传递的级联反应的蛋白质；B.分类：开关蛋白；由三磷酸鸟嘌呤核苷酸（GTP）结合蛋白组成的开关蛋白。C.作用：开关蛋白的活性由蛋白激酶使之磷酸化而关闭，由蛋白激酶去磷酸化而开启；另一类开关蛋白结合GTP而活化，结合GDP而失活。27.简述第二信使降解和分解的酶(P389-397)A.第二信使：cAMP，DAG，IP3，cGMP，Ca2+，NO等；B.腺苷酸环化酶(AC)：a.结构组成：AC为膜结合的糖蛋白，跨膜区有M1，M2两套短序列，各有6个α螺旋组成；胞内区有C1，C2两个肽端组成，具有催化作用；b.作用：催化ATP生成3'，5'-环腺苷一磷酸（cAMP）和焦磷酸，cAMP具有生物活性，其在环核苷酸磷酸二酯酶（PDEs）降解下生成5'-AMP；c.激素刺激G蛋白偶联受体，使其激活G蛋白从而影响AC的活化。C.鸟甘酸环化酶（GC）：a.结构组成：膜结合GC：跨膜区由疏水氨基酸组成；胞外区由E结构域组成，可识别其特异配体如心钠素(ANP)；胞内区由激酶样结构域（K结构域）和催化结构域（C结构域）组成；胞浆GC（可溶性GC）：由α和β亚基组成的异二聚体，其胞内区C端C结构域都为催化部位，但只有α和β聚合成异二聚体时才具有催化活性；配体为NO；b.作用：催化GTP生成3'，5'-环鸟苷酸（cGMP），cGMP在PDEs降解下生成5'-GMP；c.cGMP具有生物活性，主要在平滑肌舒张、利尿排泄、精子化学趋化等中发挥作用；d.GC集受体、信号传导分子和效应分子一体而发挥作用，不依赖其他分子（如G蛋白）帮助。D.环核苷酸磷酸二酯酶（PDEs