苏云金芽孢杆菌母药 编制说明

1《苏云金杆菌母药》修订编制说明意见、标准评审汇报等工作。草单位及有关单位的分工和大体工作进度，2770/WG/GR（October2012）。经比较，以上的WHO规格涉及的产品属于B.T.i（苏云金杆菌的以色列亚种，BacillusthurstrainAM65-52.并且一般适用于卫生消杀领域中的蚊虫防治，故对本标准3GB/T8170-2008数值修约规则与极限苏云金杆菌(Bacillusthuringiensis,简称Bt)是一种分布广泛的革兰氏昆虫尸体内及植物叶片，是一种对害虫毒力强且对天敌无毒性的昆虫病原微生剂总量的90%～95%。我国最早用于防治小菜蛾的Bt菌是库斯塔克亚种，其主效cry1Ac、cry1B、cry1C、cry1F、cry2A、cry1I、cry7Ba1c此类菌在芽孢形成时期产生一种或多种杀虫晶体蛋白(insecticidal药被广泛应用。其中对昆虫的毒性大部分或者完全取决于伴胞晶体对昆虫的毒异受体结合而形成穿孔病灶。Bt晶体蛋白作为一种胃毒素发挥作用，其对多种昆虫有杀虫活性，包括鳞翅目(Lepidoptera)、鞘翅目(Coleoplera)、双翅目4指标。本标准规定了外观、毒素蛋白质量分数、毒力效价、水分、pH值，并规毒素蛋白质量分数/%pH值水分/%H.a.代表棉铃虫(Helicoverpaarmigera（P.x.）和毒力效价（S.e.但应以毒力效价（H.a.）作为仲裁法。夜蛾(Spodopteraexigua)。当以毒素）；armigera)和(甜菜夜蛾，Spodopteraexigua)作为试验虫，可根据产品防治对5原国标规定：“两年内产品毒力效价和毒素蛋白含量均不低于指标的60%”。b）生产地址、生产设备或生产工艺有较大改变，可能影6参照NY/T4407-2023,毒素蛋白质量分数采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺三、主要试验（或验证）的分析、综合报告，技术经济论证，预期的经济效果法和SDS法，方法均具有较好的准确度和精密度，适用于工业控制分析。四、采用国际标准和国外先进标准的程度，以及与国际、国外同类标准五、与有关的现行法律、法规和强制性国家七、标准作为强制性标准或推荐性标准的建议八、贯彻标准的要求和措施建议（包括组织措施、技术措施、过渡办法等内7十一、苏云金杆菌母药产品质量测试数据和标准水平对9标准名称外观毒力效价，IU/mg毒素蛋白，%水分，%pH范围m，%本标准灰白色至棕褐色粉末≥50000≤6.04.0~7.0/GB/T19567.1-2004灰白色至棕褐色粉末≥60000IU/mg（一等品）和≥50000IU/mg（合格品B.t.a、甜菜夜蛾）；≥等品）和≥40000IU/mg（合格品）棉铃虫）≥8.0%（一等品）和≥7.0%（合格品））；7.0%（一等品）和≥6.0%（合格品B.t.k）≤6.05.5~7.0NY/T4407-2023灰白色至棕褐色粉末≥50000≤6.04.0~7.0/批号IU/mg毒素蛋pH范围水分，%HH200917462311.304.345.30HH200928591411.834.285.06HH200937127412.374.364.51HH200947169611.784.374.84HH200957556811.594.364.85HH200968679512.004.254.74HH200978348511.814.265.02HH200988961311.944.304.77HH200998180611.004.225.00HH201008065011.294.174.80批号IU/mg毒素蛋pH范围水分，%20210111540007.25.54.420210118510007.15.74.120210119570007.45.53.120210120500007.15.73.120210126530007.25.64.620210127540007.35.74.320210318510007.35.64.720210320580007.55.73.920210403560007.25.64.720210404510007.15.84.1温度条件2年降解率，%0~5℃20~25℃＜20%>30℃>30%编号（H.aIU/mgpH范围水分，%18110012.174.245.3928090011.264.255.353544007.285.534.70苏云金杆菌母药分析方法研究苏云金杆菌分析方法研究查询相关文献，参考了原行业标准，并对比了WHOspecification770/WG（October2012），经大量实验验证、对比后提出。本方法适用于苏云金杆菌毒方法来源适用菌种检测方法方法摘要本标准苏云金杆菌鲇泽亚和苏云金杆菌库斯塔克亚种（B.t.k）SDS-PAGE凝胶图像处理法试样处理：试样用水溶解；加入终浓度为0.1mol/L的氢氧化钠溶液；加入3×样品稀释液；沸水浴中煮6min；15000r/min离心5min，取上清液。SDS电泳：上样量2~10μL；初期电压100V；待试样进入分离胶后加大电压到120V。凝胶成像系统：毒素蛋白目标区带:130kDa。毒力效价法H.a.为棉铃虫(Helicoverpaarmigera)的缩写，也可选择P.x.和S.e.作为试验虫，试验结果分别表示为分别毒力效价（P.x.）和毒力效价（S.e.但应以毒力效价（H.a.）作为仲裁法。P.x.和S.e.分别为小菜蛾(Plutellaxylostella)和甜菜夜蛾(Spodopteraexigua)的缩写。WHOspecification770/WG（October2012）苏云金杆菌以色列亚种（B.t.i）SDS-PAGE凝胶图像处理法试样处理：试样用1M/5mM，NaCl/EDTA溶液溶解；离心后弃上清溶液；用5mMEDTA溶液洗涤2次，离心弃上清液；加入0.1mol/L的氢氧化钠溶液，取上清液；加入2×样品稀释液；沸水浴中煮5min；8000g离心5min，取上清液。SDS电泳：上样量10~20μL；分离胶浓度10%；凝胶成像系统：毒素蛋白目标区带:135、70和28kDa。毒力效价法B.t.i使用埃及伊蚊（Aedesaegypti）作为试虫钠，边加入边搅拌溶解，待充分溶解后，放置1mol/L、pH8.8三羟基甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液：称取三羟基甲基氨基甲1mol/L、pH6.8三羟基甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液：称取三羟基甲基氨基甲再加入3×样品稀释液0.325mL，于沸水浴中煮6min，冷却至室温，15000r/min制板:选择两块大小一样的玻璃板，其中一块一端带有2~3cm高的凹槽。制备分离胶:从冰箱中取出制胶试剂，平衡至室温。按表2先配制分离胶。将胶液配好、混匀后，迅速注入两块玻璃板的间隙中，至胶液面离玻璃板凹槽勿扰乱胶面。垂直放置胶板于室温约30min左右使之凝聚。此时，在凝胶和水///水标准曲线，取6μL的试样溶液上层清液(毒素蛋白含量约为3μg)加入到上样孔倒去染色液，先用漂洗液洗涤凝胶，然后加入脱色液，于37℃下加热使其胶板经脱色后，可清晰地看到130kDa蛋白区带，用凝胶成像系统扫描该区）；）；毒素蛋白质量分数两次平行测定结果之相对差应不大于8%，取其算术平均于聚丙烯酰胺凝胶的上样孔中分别上样2，41~5μg)，测定目标蛋白区带灰度值，以毒素蛋白质量为横坐标，对应蛋白区带12345质量在1.25μg~6.25μg之间时，与相应的蛋白区带灰度值有良测定次数12345称样量,g0.046280.046740.047090.046810.04645毒素蛋白含量，%极差，%0.62平均值，%变异系数（RSD），%2.22霍维茨值RSDR（Hor），%2.74＞2.22如图2所示，Marker为预染蛋白分子量标准，泳道1~泳道5为不同浓度毒素蛋表5不同实验室苏云金杆菌母药试样验证结果项目单位母药