DB37-T 4754.1-2024动物疫病鉴别检测技术　第1部分：猪瘟强毒与猪瘟疫苗弱毒

ICS11.220CCSB41ICS11.220CCSB41山 东 省 地 方 标 准DB37/T4754.1—20241Animaldiseaseidentificationanddetectiontechnology—Part1:ClassicalswineAnimaldiseaseidentificationanddetectiontechnology—Part1:Classicalswinefevervirulentstrainandvaccinestrain2024090320241003山东省市场监督管理局发布前 言本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。本文件是DB37/T4754《动物疫病鉴别检测技术》的第1部分。DB37/T4754已经发布了以下部分：——第1部分：猪瘟强毒与猪瘟疫苗弱毒。本文件由山东省畜牧业标准化技术委员会归口。引 言基（Classicalswinefever，CSFV）20501荧光RT-PCR鉴别检测技术的操作，便于检测技术在猪瘟临床诊断、流行病学调查、检验检疫、猪瘟疫苗质量控制等方面的稳定应用。荧光RT-PCR鉴别检测技术的操作，便于检测技术在猪瘟临床诊断、流行病学调查、检验检疫、猪瘟疫苗质量控制等方面的稳定应用。222RT-PCR3PCR动物疫病鉴别检测技术第1部分：猪瘟强毒与猪瘟疫苗弱毒范围本文件规定了猪瘟强毒与猪瘟疫苗弱毒SYBRGreenI荧光RT-PCR鉴别检测。本文件适用于猪瘟强毒与猪瘟疫苗弱毒的鉴别检测。（GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB19489实验室生物安全通用要求NY/T541兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范本文件没有需要界定的术语和定义。RT-PCR126bp335bpSYBRGreenDNATmTm注：SYBRGreenI是一种只与双链DNA小沟结合的染料。水：GB/T6682（DEPC）取1mLDEPC1000mL，24h，12115min，2℃～8（PBS）取Na2HPO4.12H2O2.9g，KCl0.2g，KH2PO40.2g，NaCl8g，溶于800mLpH7.4，1000mL，12115min，2℃～8（3%）。称取3g100mL乙二胺四乙酸（EDTA）溶液（4%）。称取4g100mL。商品化病毒核酸提取试剂盒。RT-PCR：DEPCDEPC，pH6.5～8.5PCR0.01g≥12000r/min6000r/min-70样品采样工具35min～10min，2min1602h采样NY/T5411.5mL（）1/104EDTA1mLPBS1mL32mLPBS样品的运输及保存2～824h2～82435样品处理54DEPC10000r/min5min，54DEPC10000r/min5min，410000r/min5min0.5mL10000r/min5min0.5mL10000r/min5min0.5mL核酸抽提进行猪瘟病毒检测时，生物安全按照GB19489执行，采用商品化试剂盒提取病毒核酸。荧光RT-PCR检测反应体系的配制见附录B。加样在各设定的荧光RT-PCR管中分别加入阳性对照、阴性对照和提取的试样溶液2μL，1min测定SYBRGreenI425min；9510s；510207210.1/s979结果判定质控标准9.1.1猪瘟病毒疫苗弱毒CtTm81.5±0.5Ct值＜30.0Tm81.5℃±0.5熔解峰，参见附录C（图C.1）CtTm83.3±0.9Ct值＜30.0Tm83.3℃±0.9熔解峰，参见附录C（图C.2）阴阳性结果的判定CtTm81.5±0.5CtTm81.5±0.530.0＜CtTm81.5±0.5CtTm83.3±0.9CtTm83.3±0.930.0＜CtTm83.3±0.9附录A（资料性）引物引物名称和序列见表A.1。表A.1引物名称和序列引物名称引物序列（5′—3′）猪瘟病毒疫苗弱毒上游引物GGTCTCCACAGGGGGGGT猪瘟病毒疫苗弱毒下游引物ACTATTCTGTAACCTGTCTCATTT猪瘟病毒强毒上游引物TGGCACATGGAGTTGAATCAT猪瘟病毒强毒下游引物TGCGTCTCATTGAAAAACTCTA注：引物用DEPC水溶解并稀释至100μmol/L10μmol/L保存供检测使用。附录B（资料性）荧光RT-PCR反应体系配制RT-PCRB.1表B.1RT-PCR试剂1个检测反应的加入量2×OneStepTBGreenRT-PCRBufferⅢ12.5μLPrimeScriptRTEnzymeMixⅡ0.5ExTaqHS（5U/µL）0.5猪瘟病毒疫苗弱毒上游引物1.0猪瘟病毒疫苗弱毒下游引物1.0RNaseFreedH2O7.5试样溶液2.0uL总体积25.0μLRT-PCRB.2表B.2猪瘟病毒强毒荧光RT-PCR反应体系试剂1个检测反应的加入量2×OneStepTBGreenRT-PCRBufferⅢ12.5μLPrimeScriptRTEnzymeMixⅡ0.5ExTaqHS（5U/µL）0.5猪瘟病毒强毒上游引物1.0猪瘟病毒强毒下游引物1.0RNaseFreedH2O7.5试样溶液2.0uL总体积25.0μL附录C（资料性）猪瘟疫苗弱毒与猪瘟强毒溶解曲线分析图猪瘟病毒疫苗弱毒熔解曲线分析见图C.1。标引序号说明：1——猪瘟病毒疫苗弱毒；2——