肝病肠道微生态研究进展(李兰娟院士讲座)

肝病肠道微生态研究进展李兰娟浙江大学医学院附属第一医院2006.5人体的生理指标与微生态有关肠道微生物群落是人体一个重要“器官”

Eckburg.PBetal，Diversityofthehumanintestinalmicrobialflora,Science,2005HooperLV,SCIENCE.2001;291(5505):881-4人体微生态概况人体正常菌群种类达500余种数量达100万亿个（人体体细胞只有10万亿个）重量约1271克，相当于肝脏的重量99.9%是以双歧杆菌和类杆菌为主的专性厌氧菌0.1%是以肠杆菌科细菌为主的兼性厌氧菌1g1000g(78.67%)20g200g20g10g20g肠道正常菌群完整的肠粘膜结构肠壁相关的淋巴组织表面活性剂上皮细胞黏液层

阻止过路菌的定植粘蛋白使细菌处于粘液层，以利于肠蠕动时清除肠道有益菌可增强肠上皮细胞的紧密连结，加强屏障功能肠道相关淋巴组织可起免疫清除作用肠道屏障的作用正常菌群对人体的作用

定植抗力（colonizationresistance，CR）

肠道专性厌氧菌抑制肠道内潜在原因菌过度生长和定植的能力定植抗力指标兼性厌氧的革兰阴性杆菌≤108CFU/g肠球菌≤108CFU/g酵母菌≤103CFU/g双歧杆菌/肠杆菌科细菌（B/E值）≥1.0肠道定植抗力示意图免疫调节作用具有丝裂原样作用刀豆蛋白A（ConA）样作用增强腹腔巨噬细胞的吞噬活性增加中性粒细胞吞噬活性及杀菌活性营养作用维生素的合成：VitB、VitK、叶酸短链脂肪酸的产生：丁酸对肠粘膜细胞有营养作用降低胆固醇双歧杆菌、乳杆菌、肠球菌对结合型胆汁酸有脱饱和作用,还原胆固醇为粪固醇，起降胆固醇作用降血氨作用产生酸性代谢产物，使氨、胺转变成铵离子而起降血氨作用抑制肠道产尿素酶细菌及其它腐败菌过度生长繁殖，减少氨的产生

抗衰老作用抑制肠道腐败菌腐败作用，减少有毒物质如胺、酚、吲哚、硫化氢等的产生及吸收增加血液中超氧化物歧化酶的活性和含量，减少氧自由基参与的氧化反应肝细胞功能与肠道微生态肠道菌群→Vit-K→凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ合成肠道菌群（乳酸菌等）→乙酸、丁酸等→肝细胞→能量代谢肠道菌群（梭菌、大肠杆菌、韦荣球菌、脆弱类杆菌等腐败菌）→氨、苯酚、吲哚、硫化氢等有毒物→肝细胞→解毒肝脏库普弗细胞与肠道微生态库普弗细胞数量的增加及功能的发挥与肠道微生态密切有关肝脏微生态基础肠-肝轴肝脏血液供应：肝动脉（25%）门静脉（75%）

－营养代谢肠肝循环

胆汁酸尿素激素药物细菌移位、肝脏解毒

肠-肝轴与肠道微生态肝病时肠道屏障功能的变化肝病时肠道屏障功能下降甚至衰竭，肠道通透性增加，肝硬化患者血二胺氧化酶（DAO）活性升高，尿乳果糖/甘露醇比值增加，且与病情严重程度有关原因：肠道微生态失调肠上皮细胞结构异常：肠上皮细胞变性，细胞内线粒体肿胀，紧密连接松懈免疫功能低下肠—肝轴异常：主要由于胆盐分泌减少肠道血供异常：内毒素血症、门脉高压、低蛋白等引起SIgA、防御素的变化后果：细菌易位（bacterialtraslocation），引起内源性感染，内毒素血症等继发各种感染：慢性肝病、尤其重型肝炎继发感染率达80%主要以肠道细菌为主，如大肠杆菌、肺炎杆菌、铜绿假单胞菌等其次为肺炎球菌、各型链球菌、葡萄球菌等厌氧菌：难辨梭菌等真菌：白色念株菌等继发感染的原因：广谱抗生素和免疫抑制剂等的应用肠道微生态失调，肠道定植抗力下降，肠壁屏障功能受损或衰竭，肠道细菌易位（包括及其产物如内毒素等）

肝病内源性感染感染的类型自发性细菌性腹膜炎胆道感染肠道感染败血症肺炎尿路感染真菌感染肝病内毒素血症肝病内毒素血症发生情况：慢性病毒性肝炎患者内毒素血症阳性率达80％重型肝炎达90%以上慢性重型肝炎患者阳性率近95％肝硬化患者达92.3%肝病内毒素血症发生原因：肝功能不全、清除肠源性内毒素能力下降肝病时肠道微生态失调、肠肝菌科细菌过量生长、内毒素产生↑肠道屏障功能受损，肠道内毒素过量移位内毒素加重肝脏损害通过TNF、白介素等细胞因子肠道微生态研究的主要方法细菌培养方法：经典方法，可定性定量分子生物学方法（粪便细菌）荧光定量PCR技术PCR－DGGE技术可获得肠道高丰度细菌的DNA指纹图可定性但不能定量系统生物学方法代谢组学方法:研究菌群的代谢结构,是微生态研究的主要方向无菌大鼠特点淋巴细胞少(肠道黏膜内)专性滤泡结构小血中免疫球蛋白浓度低无菌动物一旦接触菌群肠上皮内淋巴细胞数量增加，滤泡及固有层内免疫球蛋白数量增加血清中免疫球蛋白浓度上升无菌大鼠研究可以排除各种微生物的干扰可以研究机体和单一纯微生物的相互关系5日龄鼠15日龄鼠40日龄鼠经中国药品生物制品检定所检定合格肝病微生态研究方法动物模型研究（大鼠）急性肝衰竭模型肝脏缺血再灌注模型肝移植模型临床研究慢性重型肝炎患者肝硬化患者肝移植患者

对照组24小时组48小时组TP（g/L）62.6±4.548.9±3.9**

51.0±9.7**

ALB（g/L）34.3±23.627.8±2.0**30.3±3.4**

G（g/L）28.6±2.021.1±3.2**21.5±8.1**

ALT（U/L）60.6±11.04798.0±3340.0**3183.0±3973.0**

AST（U/L）137.0±24.05032.0±3201.0**2928.0±2666.0**

ALP（U/L）272.0±24.0639.0±180.0**

747.0±421.0**

TA（umol/L）11.8±8.5425.0±99.0**

262.0±183.0**

TB（umol/L）7.0±1.440.0±24.0**63.0±58.0**

与对照组比较：**表示P<0.01LiLJetal,WJG2004;10(14):2087-2090

急性肝衰竭大鼠模型

肝功能明显改变半乳糖胺造模24h后肝功能损伤严重，与对照组比较有显著性差异。P<0.012005-7-12急性肝衰竭时乳酸杆菌水平明显下降，肠杆菌科细菌明显上升肠道菌群改变急性肝衰竭大鼠模型门静脉血内毒素明显上升Ng/L急性肝衰竭时门静脉血内毒素水平明显上升急性肝衰竭大鼠模型2005-7-12肝缺血/再灌注动物模型

肝功能受损ALT（U/L）AST（U/L）正常对照假手术组模型组正常对照假手术组模型组肝缺血/再灌注时ALT及AST均明显升高*、**分别表示与假手术组比较P<0.05、0.012005-7-12肠粘膜超微结构改变A：假手术组（×17500），示微绒毛整齐，示紧密连接存在B：肝缺血-再灌注模型组（×15000，右左上角小图×3700），示微绒毛有缺失，示细胞间隙增宽AB肝缺血/再灌注动物模型肠道菌群变化****肝缺血/再灌注时肠道双歧杆菌、乳酸杆菌数量明显降低、肠杆菌明显升高lgCFU/g******,**表示与假手术组比较分别为P<0.05,P<0.01肝缺血/再灌注动物模型存在肠道细菌移位分组N肝脏脾脏肾脏肠系膜淋巴结正常对照81/8(12.5)0/80/82/8(25.0)假手术组61/6(16.7)1/6(16.7)0/62/6(33.3)模型组102/10(20.0)2/10(20.0)5/10(50%)*↑6/10(60.0)A*表示与假手术组及正常对照组比较P<0.05肝缺血/再灌注时肠道细菌移位至肾脏的数量明显增加肝缺血/再灌注动物模型血内毒素水平明显上升正常对照假手术组模型组内毒素（EU/ml）肝缺血/再灌注时血内毒素水平升高*表示与假手术组比较P<0.05肝缺血/再灌注动物模型血清肝功能水平显著异常分组（n＝6）ALT(U/L)AST(U/L)TB(umol/L)DB(umol/L)GGT（U/L）ALP（U/L）对照组36.5±10.44156.3±26.90.33±0.520.0±0.00.67±1.972107.2±672.7假手术组43.7±10.65209.2±44.50.67±0.820.33±0.521.67±1.031873.8±684.3同基因组485.3±174.8966.7±334.3**##1.50±1.761.00±0.631.83±2.562671.5±739.1异基因组2042.5±1008.9***###

△△△1748.8±637.1***###

△△3.0±2.1**#2.0±1.55**###12.5±14.2*#△2294.0±997.5与对照组比较*P<0.05**P<0.01***P<0.001与假手术组比较#P<0.05##

P<0.01###

P<0.001与同基因移植组比较△P<0.05△△P<0.01△△△P<0.001同基因移植组中AST明显升高异基因移植组中ALT，AST，总胆红素和直接胆红素明显升高肝移植动物模型DaysafterlivertransplantationTB(umol/L)020406080100D1D7D50总胆红素和直接胆红素水平升高肝移植动物模型回肠末端结构严重受损对照组和假手术组回肠末端结构正常同基因和异基因组移植后:肠粘膜充血水肿，粘液分泌增多，固有膜内有较多中性粒细胞、淋巴细胞浸润,肠黏膜绒毛断裂破损严重

A：对照组:B：假手术组C：同基因组移植D：异基因组移植肝移植动物模型肠黏膜上皮细胞超微结构破坏K：同基因移植组术后×12500）L：异基因移植组术后×12500）IJKL肠黏膜上皮细胞微绒毛整齐，致密肠黏膜上皮细胞微绒毛整齐，致密肠黏膜上皮细胞微绒毛变短，稀疏，脱失严重肠黏膜上皮细胞微绒毛变短，稀疏，脱失严重肝移植动物模型I：对照组肠黏膜：×12500)J：假手术组术后：肠黏膜上皮×12500)肠道微生态明显改变

（LgCFU/g，Mean±SD）

分组（n＝6）肠杆菌肠球菌乳杆菌双歧杆菌类杆菌对照组7.81±0.567.43±0.1210.26±0.319.52±0.848.85±1.13假手术组9.47±0.44***8.47±0.61**9.73±0.499.91±0.779.11±0.42同基因移植组9.91±0.45***△8.90±0.43***△9.19±1.18*△8.67±1.12*△9.37±0.60异基因移植组10.37±0.64***△△9.29±0.62***△△8.64±0.48**△8.48±0.38*△△9.85±1.37与对照组比较*P<0.05**P<0.01***P<0.001与假手术组比较△P<0.05△△P<0.01△△△P<0.001移植组中肠杆菌科细菌和肠球菌数量明显增加，乳杆菌和双歧杆菌数量明显降低肝移植动物模型肠道细菌移位增高（阳性数/检测数，括号内为阳性率）3/6(50.0)

*#△3/6(50.0)

*#4/6(66.7)

#5/6(83.3)

**##5/6(83.3)

**##6异基因移植组0/65/6(83.3)

**##1/6(16.7)4/6(66.7)

*#3/6(50.0)

*6同基因移植组0/60/60/60/60/66假手术组0/60/61/6(16.7)0/60/66对照组血肠系膜淋巴结肾脾肝数量分组与对照组比较*P<0.05，**P<0.01，与假手术组比较#P<0.05，##P<0.01，与同基因移植组比较△P<0.05移植组中细菌移位至肝，脾，肾脏和肠系膜淋巴结的比例明显增高肝移植动物模型血内毒素水平明显升高

对照组和假手术组各时间点内毒素水平无明显改变同基因移植组内毒素水平呈下降趋势异基因移植组内毒素水平仍高居不下肝移植动物模型P<0.001P<0.05P<0.001P<0.01双歧杆菌类杆菌双歧杆菌、类杆菌显著减少慢性重型肝炎患者肠道微生态研究P<0.001P<0.05肠杆菌科细菌肠球菌酵母菌P<0.01P<0.05P<0.001P>0.05肠杆菌科细菌↑肠球菌↑、酵母菌↑慢性重型肝炎患者肠道微生态研究P<0.001P<0.05ng/L血内毒素水平明显上升慢性重型肝炎患者肠道微生态研究

正常组肝硬化组肝移植组

N=28N=51N=111总细菌

11.87±0.28

11.63±0.39*

11.61±0.43**类杆菌

11.44±0.2711.08±0.7811.02±0.94双歧杆菌9.05±1.337.69±1.26***

7.99±1.31**粪细菌10.17±0.979.65±1.438.88±1.82**#一类梭菌8.49±1.028.61±1.138.42±1.02二类梭菌7.47±0.508.16±0.88**

7.94±0.85*三类梭菌11.03±0.6910.82±0.6910.78±0.69胞笛特梭菌8.06±0.418.00±1.118.49±1.12#乳杆菌8.25±0.738.49±1.047.40±0.85***##肠杆菌8.18±0.398.92±0.96*

8.98±1.19**肠球菌5.74±0.836.06±0.607.14±1.11***##肝移植患者肠道总细菌量、双歧杆菌、乳酸杆菌、及粪细菌(F.prausnitzii)数量显著减少肠道4类梭菌、肠杆菌科细菌及肠球菌显著增加肠道菌群结构明显改变肝移植患者肠道肠道微生态研究肠道双歧杆菌的种群生态分布有显著的变化青春双歧杆菌（B.adolescentis）数量↓↓（假）小链状双歧杆菌（B.cat.group）数量↓↓长双歧杆菌（B.longum）数量↑↑双歧杆菌种群结构有明显变化肝移植患者肠道微生态研究细菌移位分析(8/78例)

1有661.2C肠球菌阴性肠球菌(血)2无531.5CE.coli阴性阴性3无699.1C阴性E.coli

E.coli(胆汁)4有453.6C肠球菌阴性5无22BE.coli阴性E.coli(血)6无180.7B阴性产气肠杆菌

产气肠杆菌(血)7无294.4B白色念珠菌

白色念珠菌阴性8无46.6B阴性E.coli

E.coli(血)编号腹水TB分级肠系膜淋巴结门静脉血术后（标本）细菌移位的部位以肠系膜淋巴结(MLN)为主，占62.5%(5/8)发生移位的细菌主要是肠道革兰阴性兼性厌氧杆菌（占55.6%,5/9），其次为革兰阳性兼性厌氧球菌（占22.2%,2/9）

肝移植患者肠道微生态研究血内毒素与肠杆菌科细菌数量成正相关血内毒素与乳杆菌数量成负相关血内毒素水平高低与肠道微生态失衡有密切关系大鼠移植肝慢性失功(CGD)参数A参数Brp内毒素肠杆菌科0.410P<0.05内毒素乳杆菌-0.453P<0.05微生态与内毒素相关性分析血内毒素与肠杆菌科细菌数量成正相关血内毒素与双歧杆菌数量成负相关慢性重型肝炎患者微生态与内毒素相关性分析血内毒素、TNF、IL-1、TBiL的变化379.61±129.26

***28.07±17.87

***11.85±3.76TBiL(mol/L)110.57±31.78

***

76.58±47.20

***18.64±7.36IL-1(ng/ml)35.76±17.18

†

**

22.96±15.80

**

10.90±4.32TNF(ng/ml)74.79±34.12

***

‡40.94±16.42

**26.55±11.12血内毒素(ng/L)重肝组（30例）慢肝组（34例）对照组（31例）项目组别与对照组比较:*P＜0.05，**

P＜0.01，***P＜0.001

与慢肝组比较：†

P＜0.01，‡

P＜0.001†‡‡肝病肠道微生态干预研究常见微生态制剂益生菌（probiotic）是一些有益菌：如乳杆菌和双歧杆菌等能够促进肠道内菌群生态平衡，对宿主起有益作用益生元（prebiotic）不是细菌，如乳果糖，拉克替醇等能选择性的促进体内有益菌的生长的一些物质合生元益生菌+益生元不是两者简单的相加,是有选择的组合国际上常采用乳杆菌和发酵纤维联合应用植物乳杆菌(Lb.plantarum)干预降低急性肝损伤大鼠肠道内肠杆菌的数量减轻肝脏损伤国外研究表明益生菌可降低急性肝损伤大鼠肝功能水平DIYAADAWI,etal.HEPATOLOGY1997;25:642-647微生态制剂改善肝缺血/再灌注大鼠的肝功能**、**分别表示与模型组比较P<0.05、P<0.01补充双歧杆菌、混合制剂可使大鼠ALT及AST均明显改善补充乳酸杆菌可使大鼠ALT明显改善益生菌改善肝缺血/再灌注大鼠肠粘膜结构B：肝缺血-再灌注模型组（×15000，左上角小图×3700），微绒毛有缺失（S），细胞间隙增宽（W）补充双歧杆菌和乳酸杆菌混合制剂可使大鼠肠粘膜结构明显改善A：假手术组（×17500），微绒毛整齐，紧密连接存在，T所指为桥粒C：双歧组(×6200，bar=2

m,左上角×24000)E:混合组(×12500；左上角×15000)F：庆大霉素预处理组（×17500），箭头所指为增宽的细胞间隙D:乳酸组(×6200,左下角×3700；右下角×30000)微生态制剂可改善肝缺血/再灌注大鼠肠道细菌移位*表示与模型组比较P<0.05分组肝脾肾肠系膜淋巴节对照组1/6(16.7)1/6(16.7)0/6*2/6(33.3)模型组2/8(25.0)2/8(25.0)4/8(50)5/8(62.5)双歧组2/9(22.2)1/9(11.1)2/9(22.2)3/9(33.3)乳酸组3/9(33.3)1/9(11.1)2/9(22.2)3/9(33.3)混合组1/8(12.5)1/8(12.5)0/8*4/8(50.05)庆大组2/7(28.6)3/7(42.9)1/7(14.3)2/7(28.6)补充双歧杆菌与乳酸杆菌可明显改善肠道细菌移位至肾脏微生态制剂可改善肝缺血/再灌注血内毒素水平*,**分别示与模型组(I/R组)比较P<0.05,P<0.01;†示与对照组比较P<0.05

补充益生菌可降低肝I/R大鼠血内毒素水平分组（n＝6）ALT(U/L)AST(U/L)TB(umol/L)DB(umol/L)GGTALP（U/L）对照组313.5±95.8592.5±250.246.5±52.630.3±35.134.5±31.21368.2±511.2乳杆菌组250.3±9.27370.0±97.6*8.00±2.90*4.33±2.58*29.3±7.371894.0±480.2乳果糖组173.3±81.1**363.0±59.6*11.2±5.884.83±3.48*31.3±18.1941.5±453.1△

与对照组比较*P<0.05**P<0.01与乳杆菌组比较△P<0.01持续补充乳酸杆菌可降低移植术后AST，TB以及DB水平持续补充乳果糖可降低移植术后ALT，AST以及DB水平补充微生态制剂可改善移植大鼠肝功能

微生态制剂改善移植大鼠回肠末端病理损伤

（×200）对照组：小肠粘膜充血水肿，黏膜绒毛断裂破损严重补充乳杆菌组：肠黏膜绒毛表面尚光滑，整洁；与对照组相比有明显改善补充乳果糖组：回肠末端结构基本正常，杯状细胞明显增多，绒毛表面尚光滑，整洁，与对照组相比也有改善

对照组乳杆菌组乳果糖组补充微生态制剂改善移植大鼠微生态状况

（LgCFU/g，Mean±SD）分组（n＝6）肠杆菌肠球菌乳杆菌双歧杆菌类杆菌对照组10.37±0.649.29±0.628.88±0.4110.15±0.509.85±1.37乳杆菌组8.92±1.06**7.81±0.78**9.61±0.60*9.64±0.389.88±0.28乳果糖组9.56±0.348.14±0.93*9.72±0.38**10.56±0.50△

9.70±0.15与对照组比较*P<0.05**P<0.01与乳杆菌组比较△P<0.01补充乳酸杆菌可增加大鼠肠道乳杆菌含量，降低肠杆菌和肠球菌含量补充乳果糖可增加大鼠乳杆菌和双歧杆菌含量补充乳酸杆菌和乳果糖可改善移植大鼠

肠道细菌移位率

（阳性数/检测数，括号内为阳性率）分组数量肝脾肾肠系膜淋巴结血对照组65/6(83.3)5/6(83.3)4/6(66.7)4/6(66.7)3/6(50.0)乳杆菌组60/6**