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DB41DB41/T1422—2017蝴蝶兰建兰花叶病毒实时荧光RT-PCR检测方法2017-07-07发布2017-10-07实施河南省质量技术监督局发布I1蝴蝶兰建兰花叶病毒实时荧光RT-PCR检测方法建兰花叶病毒为ssRNA病毒，通过反转录酶和DNA聚合酶的作用将RNA反转录为cDNA，针对核酸保守时PCR所需的循环次数为Ct值，与样本细胞中表达稳定、丰度较低的基因（内参基因，2蝴蝶兰建兰花叶病毒的实时荧光RT-PCR特异性引物为Cymv-F：5’-TGCCAGACGGTGCTATCGTA-3’、Cymv-R：5’-AGAAAGGTGGAAG蝴蝶兰实时荧光RT-PCR内参引物为PeActin-F：5’-CTCTTTCACAACCACTGCGG-3’、PeActin-R：5’-TGGGCACCTAAATCTCTCAGC-3’3将制备好的样品置于实时荧光PCR仪上，设置95查看扩增曲线（图2）。扩增曲线包括荧光背景信号阶段、荧光信号指数扩增阶段和平台46.6.1待测样品内参基因PeActin引物Ct值为18≤Ct≤20，Cymv引物Ct值为40时，判定结果为阴6.6.2待测样品内参基因PeActin引物Ct值为18≤Ct≤20，Cymv引物Ct值为≤35时，则判定结果6.6.3待测样品内参基因PeActin引物Ct值为18≤Ct≤20，Cymv引物Ct值为35＜Ct＜40时，应重新进行测试。如果测试的Cymv引物Ct值为40时，则判定结果为阴性；如果重新测试的Cymv引物Ct5建兰花叶病毒病毒颗粒呈线状，长度475nm，宽度13nm，螺旋对糖蛋白体，有一种结构蛋白（外壳蛋白）和基因组ssRNA组成。外壳蛋白的分子量为23.6kDa左右220个氨基酸组成。核酸为线性正义链ssRNA，分子量为稀释限点5×10-5，钝化温度65℃~70℃。通过一次PEG沉淀，在蔗糖密度梯度离心后病毒成明显的条CymMV的RNA基因组全长为6227bp，3’末端有poly（A）加尾，5’端有带帽结构，与马铃薯X属类似。其基因组结构包括5个开放式阅读框（ORFORF1编码CymMV所编码的蛋白与马铃薯X病毒属其它成员编码的对应蛋白有很高的同源性。不

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