生物学案：专题课题血红蛋白的提取和分离

学必求其心得，业必贵于专精学必求其心得，业必贵于专精学必求其心得，业必贵于专精课题3血红蛋白的提取和分离1．尝试对血液中血红蛋白的提取和分离。2．体验从复杂体系中提取生物大分子的基本过程和方法.3．了解色谱法、电泳法等分离生物大分子的原理。蛋白质的各种特性的差异如分子的______和______、所带________________、溶解度、________和对其他分子的亲和力，等等，可以用来分离不同种类的蛋白质.一、凝胶色谱法1．概念：凝胶色谱法也称做__________，是根据____________的大小分离蛋白质的有效方法.2．原理：大多数凝胶是由________化合物构成的小球体，内部有许多贯穿的通道,当不同的蛋白质通过凝胶时,相对分子质量____的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程______，移动速度______；而相对分子质量______的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在________移动,路程______，移动速度______。相对分子质量不同的蛋白质因此得以分离。3．凝胶材料：______性,______类化合物，如葡聚糖或________。4．具体过程：（1)________混合物上柱.（2)洗脱开始，______________的蛋白质______进入凝胶颗粒内；相对分子质量______的蛋白质则被排阻于凝胶颗粒之外。（3)________________的蛋白质被滞留；__________________的蛋白质向下移动。（4)相对分子质量不同的分子完全分开。（5)____________的蛋白质行程较短，已从________中洗脱出来，________________的蛋白质还在行进中。提示:洗脱：从色谱柱上端不断注入缓冲液，促使蛋白质分子的差速流动。二、缓冲溶液1．作用：在________内，能够抵制外界的________对溶液____的影响，维持____基本不变.2．配制:通常由________溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的______就可以制得在不同________使用的缓冲液。三、电泳1．概念:带电粒子在______的作用下发生______的过程。2．原理:许多重要的生物大分子，如______、______等都具有________的基团,在一定pH下，这些基团会带上______或______.在电场的作用下,这些带电分子会向着与所带电荷__________移动.电泳利用了分离样品中各种分子__________以及分子本身的______、______不同，使带电分子产生不同的________，从而实现样品中各种分子的分离。3．分类:________凝胶电泳、__________凝胶电泳。在测定蛋白质相对分子质量时通常使用__________________凝胶电泳.蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它所带________的多少以及__________等因素。而在SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳中,SDS能使蛋白质发生________，由几条肽链组成的蛋白质复合体在SDS的作用下会______成单条肽链，因此测定的结果只是________的相对分子质量。同时SDS所带的大量负电荷大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，因而掩盖了不同种蛋白质间的电荷差别，使电泳迁移率完全取决于__________。四、蛋白质的提取和分离蛋白质的提取和分离一般分为四步：________、粗分离、______和________.1．样品处理及粗分离血液由__________和__________组成,其中红细胞最多。红细胞的组成中,除水分以外,约90％是__________.血红蛋白由______条肽链组成，包括两条__________和两条__________。其中每条肽链环绕一个__________基团，此基团可携带一分子氧或一分子__________。血红蛋白因含有________而呈现____色。（1)红细胞的洗涤①目的:去除________。②方法:采用________离心，如500r·min－1离心2min，然后用胶头吸管吸出上层透明的黄色______，将下层______的红细胞液体倒入______，再加入五倍体积的________,缓慢搅拌________,低速短时间离心,如此重复洗涤三次,直至上清液中没有______，表明红细胞已洗涤干净。（2)血红蛋白的释放将洗涤好的红细胞倒入烧杯中，加________到________体积，再加40％体积的______，置于磁力搅拌器上充分搅拌10min。在________和________的作用下，红细胞______，释放出血红蛋白.（3）分离血红蛋白溶液：将搅拌好的混合液离心后可观察到试管中溶液分为4层（从上往下）:第1层：________的甲苯层.第2层：脂溶性物质的沉淀层——______薄层固体.第3层：________的水溶液-—红色透明液体.第4层：其他杂质的________沉淀物。将液体用______过滤，除去________________，于分液漏斗中静置片刻后，分出下层的________液体.（4）透析：取1mL的________溶液装入________中，将其放入盛有300mL的物质的量浓度为20mmol·L－1的__________中(pH为______)，透析12h。透析袋一般是用硝酸纤维素(又称玻璃纸）制成的，能使______自由进出，而将______保留在袋内。透析可以去除样品中相对分子量较____的杂质，或用于更换样品的______。2．纯化——凝胶色谱操作处理后的样品还含有其他种类的蛋白质分子（如呼吸酶等)，因此要将杂蛋白与血红蛋白进行分离。第一步要制作__________。第二步要__________________，因为____的凝胶和用________平衡好的凝胶的体积差别很大，所以装柱前需要根据色谱柱的内体积计算所需要的凝胶量。在装填凝胶柱时，不能有______存在。第三步是样品的______和______。3．纯度鉴定—-SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳判断________的蛋白质是否达到要求，需要进行蛋白质纯度的鉴定。鉴定方法中使用最多的是SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳。五、注意事项1．红细胞的洗涤洗涤次数、离心速度与离心时间十分重要。洗涤次数过少，无法除去________;离心速度过高和时间过长会使________等一同沉淀，达不到分离的效果，影响后续血红蛋白的提取纯度.2．色谱柱填料的处理商品凝胶是干燥的颗粒，使用前需直接放在________中膨胀。为了加速膨胀，可以将加入__________的湿凝胶用________加热，逐渐升温至接近沸腾.这种方法不仅时间______，还能除去凝胶中可能带有的________，排除胶粒内的______。3．凝胶色谱柱的装填装填凝胶时要尽量________,从而降低颗粒之间的空隙.不能有________存在，因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的________，降低分离效果。洗脱液不能______，露出凝胶颗粒，否则需重新装填。4．蛋白质的分离分离过程中，仔细观察________在洗脱过程中的移动情况。如果色谱柱装填成功、分离操作正确，能清楚地看到红色区带狭窄、平整、均匀一致地随着洗脱液缓慢移动；如果红色区带歪曲、散乱、变宽，说明分离效果不好，与凝胶色谱柱的装填有关。答案：形状大小电荷的性质和多少吸附性质一、1.分配色谱法相对分子质量2．多糖类较小较长较慢较大凝胶外部较短较快3．多孔多糖琼脂糖4．（1）蛋白质(2)相对分子质量较小扩散较大(3）相对分子质量较小相对分子质量较大（5）相对分子质量较大层析柱相对分子质量较小二、1.一定范围酸和碱pHpH2．1～2种缓冲剂使用比例pH范围内三、1.电场迁移2．多肽核酸可解离正电负电相反的电极带电性质不同大小形状迁移速度3．琼脂糖聚丙烯酰胺SDS—聚丙烯酰胺净电荷分子的大小完全变性解聚单条肽链分子的大小四、样品处理纯化纯度鉴定1．血浆血细胞血红蛋白四α肽链β肽链亚铁血红素二氧化碳血红素红（1）杂蛋白低速短时血浆暗红色烧杯生理盐水10min黄色（2）蒸馏水原血液甲苯蒸馏水甲苯破裂（3)无色透明白色血红蛋白暗红色滤纸脂溶性沉淀层红色透明(4）血红蛋白透析袋磷酸缓冲液7.0小分子大分子小缓冲液2．凝胶色谱柱装填凝胶色谱柱干缓冲液气泡加入洗脱3．纯化五、1。血浆蛋白白细胞2．洗脱液洗脱液沸水浴短微生物空气3．紧密气泡洗脱次序流干4．红色区带1．血红蛋白分离的完整过程血红蛋白提取和分离的程序可分为四大步，分别是样品处理、粗分离、纯化和纯度鉴定。首先通过洗涤红细胞、血红蛋白的释放、离心等操作收集到血红蛋白溶液，即样品的处理;再经过透析去除相对分子质量较小的杂质,即样品的粗分离；然后通过凝胶色谱法将相对分子质量大的杂质蛋白除去,即样品的纯化；最后经聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯度鉴定.不是所有种类的蛋白质的提取和分离都是这样的，蛋白质的来源和性质不同，分离方法差别很大.提取血红蛋白的实验材料要选择哺乳动物血液，因为其红细胞中无细胞核,结构简单，血红蛋白含量高。而提取DNA的实验材料要选择鸡的红细胞,因为其具有细胞核,含有DNA。2．缓冲溶液在一定范围内,能对抗少量外来强酸、强碱或稍加稀释不引起溶液pH发生明显变化的作用叫做缓冲作用，具有缓冲作用的溶液叫做缓冲溶液.缓冲溶液通常是由一种或两种化合物(缓冲剂)溶解于水中制得的,调节缓冲剂的配比就可制得不同pH范围的缓冲液。缓冲溶液的作用是维持反应体系的pH不变.在生物体内进行的各种生物化学过程都是在精确的pH下进行的，受到氢离子浓度的严格调控。为了在实验室条件下准确地模拟生物体内的天然环境，就必须保持体外生物化学反应过程有与体内过程完全相同的pH。实验中缓冲液用量要远多于血红蛋白溶液量，有利于杂质分子充分地向外扩散。3．用SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质的相对分子质量使用SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质的相对分子质量时，可选用一组已知相对分子质量的标准蛋白同时进行电泳，根据已知相对分子质量的标准蛋白的电泳区带位置，用电泳迁移率和相对分子质量的对数作标准曲线，可以测定未知蛋白质的相对分子质量。具体步骤如下:(1）根据厂家说明书安装电泳用的玻璃板；（2）SDS—聚丙烯酰胺凝胶制备；(3）样品处理;（4）把凝胶固定于电泳装置上；（5）加样：按顺序加样，加样量通常为10~25μL，样品可以多加几个；（6)电泳；（7)剥胶；（8)染色；(9）脱色;（10）观察结果.SDS电泳的成功关键之一是电泳过程中，特别是样品制备过程中蛋白质与SDS的结合程度.由于制备凝胶的丙烯酰胺和双丙烯酰胺具有很强的神经毒性，并且容易被皮肤吸收,因此操作必须在通风橱内或通风处进行.TEMED和过硫酸铵对黏膜和上呼吸道组织、眼睛、皮肤等有很大的破坏作用，吞服可致命.因此在进行电泳操作时一定按照实验要求和步骤,在老师的指导下完成。操作时要戴好一次性手套.4．凝胶色谱操作中凝胶的装填凝胶色谱操作中凝胶的装填要紧密、均匀.凝胶实际上是一些微小的多孔球体,小球体内部有许多贯穿的通道。相对分子质量较大的蛋白质分子不能进入凝胶颗粒内部，只能分布在颗粒之间,通过的路程较短，移动速度较快；相对分子质量较小的蛋白质分子比较容易进入凝胶内的通道，通过的路程较长，移动速度较慢。因此,样品中相对分子质量较大的蛋白质先流出，相对分子质量中等的分子后流出，相对分子质量最小的分子最后流出，从而使各种相对分子质量不同的分子得以分离。如果凝胶装填得不够紧密、均匀,就会在色谱柱内形成无效的空隙,使本该进入凝胶内部的样品分子从这些空隙中通过,搅乱洗脱液的流动次序，影响分离的效果。题型一凝胶色谱法的原理与操作【例题1】利用凝胶色谱法什么样的蛋白质先洗脱出来？（）A．相对分子质量较大的 B．溶解度高的C．相对分子质量较小的 D．所带电荷多的解析:相对分子质量较小的蛋白质能进入凝胶内部通道，路程较长，移动速度较慢；相对分子质量较大的蛋白质，路程较短，移动速度较快，首先洗脱出来.答案：A反思领悟：凝胶色谱法是根据相对分子质量的大小分离蛋白质的有效方法.题型二电泳技术的原理与操作【例题2】关于电泳的说法不正确的是（）。A．电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程B．带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动C．蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它所带净电荷的多少D．用SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳，蛋白质的电泳迁移率完全取决于分子的大小解析：蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它所带净电荷的多少以及分子的大小等因素,SDS能与各种蛋白质形成蛋白质—SDS复合物,SDS所带负电荷的量大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，因而掩盖了不同种蛋白质间的电荷差异，使电泳迁移率完全取决于分子的大小。答案：C反思领悟：电泳利用了分离样品中各种分子带电性质不同以及分子本身的大小、形状不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离.题型三蛋白质的提取和分离【例题3】（2011·广东理综）以下关于猪血红蛋白提纯的描述,不正确的是（).A．洗涤红细胞时,使用生理盐水可防止红细胞破裂B．猪成熟红细胞中缺少细胞器和细胞核，提纯时杂蛋白较少C．血红蛋白的颜色可用于凝胶色谱法分离过程的监测D．在凝胶色谱法分离过程中，血红蛋白比相对分子质量较小的杂蛋白移动慢解析：大分子物质由于分子直径较大,不易进入凝胶颗粒的微孔,而只能分布颗粒之间，所以在洗脱时向下移动的速度较快，相反，相对分子质量较小的物质向下移动速度较慢。答案：D1．凝胶色谱法是分离蛋白质分子的一种常用方法。但并非所有的蛋白质都可用此方法进行分离.能分离的蛋白质分子之间必须（）。A．具有相同的相对分子质量B．相对分子质量不同，但都是相对分子质量较大的分子C．相对分子质量不同，但都是相对分子质量较小的分子D．相对分子质量不同2．电泳过程中，什么样的分子迁移速度最快?(）A．纤维状、大分子 B．纤维状、小分子 C．球状、大分子 D．球状、