第六分子发光分析法

第六分子发光分析法优选第六分子发光分析法分子发光按激发的模式分类：光致发光化学发光生物发光

分子发光荧光磷光按光子能量分类：斯托克斯荧光(Stokes)：λex<λem反斯托克斯荧光(Antistokes)：λex>λem共振荧光(Resonance)：λex=λem荧光

分子发光分析：依据物质分子吸收一定的能量跃迁到较高电子激发态后，在返回基态时有光谱辐射而建立的分子方法。第一节分子发光的基本原理一、分子荧光及磷光光谱的产生1.1荧光及磷光的产生分子中电子能级、振动能级和转动能级示意图电子能级振动能级转动能级单重态：如果分子中全部轨道里的电子都是自旋配对的，即s=0,分子的多重度=1,该分子体系处于单重态基态(S0):室温下，分子处于基态的振动能级。所有电子遵从能量最低原理、Pauli不相容原理和洪特规则。激发态:被激发后,能量变高,属非稳状态。单重态（S）三重态（T）基态S0第一电子激发态S1第二电子激发态S2三重态T1T2三重态：如果电子在跃迁过程中还伴随着自旋方向的改变，这时分子具有两个自旋不配对的电子洪特规则：处于分立轨道上的非成对电子，平行自旋要比成对自旋更稳定。Pauli不相容原理：分子中同一轨道所占据的两个电子必须具有相反的自旋方向，即自旋配对。【例】：-OH、-OR、-NH2、-CN、-NR2等；表8-羟基喹啉在不同溶剂中的荧光峰和荧光效率氟苯的荧光效率0.荧光光谱只含一个发射带.荧光强度(磷光)与浓度的关系3）外转换（ExternalConversion，EC）荧光强度F正比于吸收的光量Ia和荧光量子效率：K2[M*][Q]例：维生素A327nm510nm较浓溶液，由于猝灭现象和自吸收等原因，使荧光强度和浓度不呈线性关系。测量荧光的仪器主要由四个部分组成：激发光源、样品池、双单色器系统、检测器。食品:食品添加剂、维生素含量、甾体、抗生素、酶和辅酶等的分析共振荧光(Resonance)：λex=λem分子产生荧光必须具备的条件：氟、硫、铁、银、钴、镍采用荧光熄灭法测定；激发态→基态的能量传递途径

电子处于激发态是不稳定状态，返回基态时，通过辐射跃迁(发光)和无辐射跃迁等方式失去能量；传递途径辐射跃迁荧光延迟荧光磷光内转移外转移系间跨越振动弛预无辐射跃迁激发态停留时间短、返回速度快的途径，发生的几率大，发光强度相对大；荧光：10-6～10-9s,第一激发单重态的最低振动能级→基态；磷光：10-4～10s；第一激发三重态的最低振动能级→基态；1）振动弛豫（VibrationalRelaxation,VR）在同一电子能级中，电子由高振动能级迅速转至该电子能级低振动能级，将多余的能量以分子振动能形式消耗掉一部分，这样的过程，称为振动弛豫。

高振动能级→低振动能级发生振动弛豫的时间：10-12s第一电子激发态第二电子激发态三重态S2S1基态S0T1振动弛豫设处于基态单重态中的电子吸收波长为λ1和λ2的辐射光之后，分别激发至第二单重态S2及第一单重态S1。λ1λ2l2l12）内转换（InternalConversion，IC）当两个电子能级非常靠近,以致其振动能级有重叠时，发生电子由高能级以无辐射跃迁方式转移至低能级，相同多重态的两个电子态间的非辐射跃迁【例】:高电子能能级→→低电子能级S2→→

S1T2→→T1发生内转换的时间：10-13

～10-11s第一电子激发态第二电子激发态三重态S2S1基态S0T1T23）外转换（ExternalConversion，EC）

受激分子与溶剂或其它分子相互作用发生能量转换,而使荧光或磷光强度减弱甚至消失的过程，也称“熄灭”或“猝灭”（quenching）。4）系间窜跃（IntersystemConversion，ISC）

两个不同多重态之间的无辐射跃迁，如从S1到T1，该跃迁是禁阻的。但当不同多重态的两个电子能级有较大重叠时，处于这两个能级上的受激电子的自旋方向发生变化，即可通过自旋-轨道耦合而产生无辐射跃迁，该过程称为系间窜跃。

不同多重态的两个电子能态间的非辐射跃迁猝灭剂：能引起荧光猝灭的物质。二级瑞利散射和丁达尔散射400500600700【例】：荧光素钠的乙醇溶液-80℃，对于稀溶液，当bc<0.空间位阻对荧光发射的影响表8-羟基喹啉在不同溶剂中的荧光峰和荧光效率基态上的零振动能级与第一激发态的二振动能级之间的跃迁几率最大，相反跃迁也然。250nm:基态到第二激发态的跃迁电子跃迁到不同激发态能级，吸收不同波长的能量(如能级图2,1)，产生不同吸收带，但均回到第一激发单重态的最低振动能级再跃迁回到基态，产生波长一定的荧光(如‘2)。原因:ΔE激发≠ΔE发射两个不同多重态之间的无辐射跃迁，如从S1到T1，该跃迁是禁阻的。（1）无机化合物的荧光分析荧光强度(磷光)与浓度的关系散射：当一束平行光投射在液体样品时，大部分光线透过溶液，小部分光由于光子与物质分子相碰撞，使光子的运动方向发生改变而向不同角度散射。第一电子激发态第二电子激发态三重态S2S1基态S0T1T25）荧光发射荧光：分子中电子从单重激发态的最低振动能级在很短时间（10-9-10-6s）跃迁到基态各振动能级时所产生的光子辐射称为荧光。荧光发射：产生荧光的过程S1→→S0第一电子激发态第二电子激发态三重态荧光S1基态S0T1T2S26）.磷光发射

从单重态（S）到三重态（T）分子间发生系间跨越跃迁后，再经振动弛豫回到三重态最低振动能层，最后，在10-4-10s内跃迁到基态的各振动能层所产生的辐射。第一电子激发态第二电子激发态三重态磷光S2S1基态S0T1T2S2S1S0T1吸收发射荧光发射磷光系间窜跃内转换振动弛豫能量l2l1l

3

外转换l

2T2内转换振动弛豫分子内的光物理过程1.2激发光谱与荧光(磷光)光谱1.荧光(磷光)的激发光谱曲线固定测量波长(选最大发射波长),化合物发射的荧光(磷光)强度与照射光波长的关系曲线（图中曲线I）。激发光谱曲线的最高处，处于激发态的分子最多，荧光强度最大；2.荧光光谱(或磷光光谱)

固定激发光波长(选最大激发波长),化合物发射的荧光(或磷光强度)与发射光波长关系曲线(图中曲线II或III)。3.激发光谱与发射光谱的关系a.Stokes位移激发光谱与发射光谱之间的波长差值。发射光谱的波长比激发光谱的长，振动弛豫消耗了能量。b.发射光谱的形状与激发波长无关电子跃迁到不同激发态能级，吸收不同波长的能量(如能级图

2,

1)，产生不同吸收带，但均回到第一激发单重态的最低振动能级再跃迁回到基态，产生波长一定的荧光(如

‘2)。c.

镜像规则通常荧光发射光谱与它的吸收光谱（与激发光谱形状一样）成镜像对称关系。镜像规则的解释基态上的各振动能级分布与第一激发态上的各振动能级分布类似；基态上的零振动能级与第一激发态的二振动能级之间的跃迁几率最大，相反跃迁也然。

200250300350400450500荧光激发光谱荧光发射光谱nm蒽的激发光谱和荧光光谱1荧光量子产率分子产生荧光必须具备的条件：i）分子具有与辐射频率相应的荧光结构（内因）；ii）吸收特征频率的光后，具一定光量子产率的荧光。即荧光量子产率（荧光效率或量子效率）

足够大.二、荧光与分子结构的关系∑ki:其它有关过程的速率常数荧光量子产率/荧光效率或量子效率：物理意义：表示物质发射荧光的能力。影响因素：kf

由分子化学结构决定（内因）∑ki由化学环境和化学结构决定

kf:荧光发射过程的速率常数F=K’I0(1-10-bc)=K’I0(1-e-2.【例】：萘环上的8位引入磺酸基，使-NH2或-N(CH3)2基与萘之间的键发生扭转而离开了平面构型，影响了p-共轭，消弱了电子共轭程度，荧光减弱。猝灭剂：能引起荧光猝灭的物质。分子产生荧光必须具备的条件：荧光发射：产生荧光的过程电子处于激发态是不稳定状态，返回基态时，通过辐射跃迁(发光)和无辐射跃迁等方式失去能量；振动能级和转动能级示意图重原子降低荧光但增强磷光荧光效率100％.分子产生荧光必须具备的条件：发射光谱的波长比激发光谱的长，振动弛豫消耗了能量。跃迁是产生荧光的主要跃迁类型。S2→→S1由朗-比耳定律：Ia=I0(1-10-bc)无机化合物与某种试剂反应，利用荧光呈现或淬灭来测定。I.有机化合物的荧光1）跃迁类型：

跃迁是产生荧光的主要跃迁类型。

n

振动弛豫激发

n荧光2、荧光与分子结构的关系2）共轭效应：♪脂肪族和脂环族化合物少例：维生素A327nm510nm♪芳香族化合物共轭度越大，荧光越强。原因：电子非定域性越大，易激发，从而有利于荧光的发生。【例】:在苯中荧光效率ph（CH=CH）3ph0.68ph（CH=CH）2ph0.28化合物

f0.110.290.460.600.52苯萘蒽丁省戊省3）刚性结构：多数具有刚性平面结构的有机分子具有强烈的荧光。原因：这种结构可以减少分子的振动，使分子与溶剂或其它溶质分子的相互作用减少，也就减少了碰撞去活的可能性。

分子刚性（Rigidity）越强，分子振动少，与其它分子碰撞失活的机率下降，荧光量子效率提高。

OHCOO

CHO

OHCOO

C

OHO荧光素（

大）

酚酞（

=0）

4）取代基效应：①给电子取代基增强荧光原因：p-共轭，增强了电子共轭程度，使最低激发单重态与基态之间的跃迁几率增大。【例】：-OH、-OR、-NH2、-CN、-NR2等；②吸电子基降低荧光例：-COOH、-C=O、-NO2、-NO、-X、（-NH-N=N-）等；【例】：硝基苯为非荧光物质，苯酚、苯胺荧光较苯强。化合物荧光的相对强度化合物荧光的相对强度苯10氟代苯10甲苯17氯代苯7丙基苯17溴代苯5苯基氰20碘代苯0苯酚18酚离子10苯胺20苯甲酸3苯胺离子0硝基苯0表不同取代基对苯环荧光相对强度的影响

③重原子效应将一个高原子序数的原子引入到发光分子的

电子体系中，往往会增强磷光而减弱荧光。原因：原子序数较高的原子中，能级之间的交叉现象比较严重，电子自旋轨道间的相互作用变大，更有利于电子自旋的改变，增加了由单重态转化为三重态的速率，发生自旋轨道的相互作用，增大了系间跨越的速度，而使荧光减弱，磷光增强。S1→T1的系间窜跃由于重原子的存在增强重原子降低荧光但增强磷光重原子效应：将一个高原子序数的原子引入到发光分子的电子体系中，会增加磷光而减弱荧光现象。【例】：氟苯的荧光效率0.16氯苯的荧光效率0.05溴苯的荧光效率0.01磷光顺序荧光顺序④取代基的空间位置影响

分子结构空间障碍的影响【例】：萘环上的8位引入磺酸基，使-NH2或-N(CH3)2基与萘之间的键发生扭转而离开了平面构型，影响了p-共轭，消弱了电子共轭程度，荧光减弱。N(CH3)2-O3SN(CH3)2O3S

=0.03

=0.75

5）立体异构现象的影响【例】：空间位阻对荧光发射的影响反式二苯乙烯强荧光物质

F=0.75

F=0.03立体异构体对荧光发射的影响顺式二苯乙烯非荧光物质非平面构型平面构型强荧光的有机化合物具备下特征:①具有大的共轭π键结构；②具有刚性的平面结构；③具有最低的单重电子激发态为S1为π

*→π型；④取代基团为给电子取代基。小结：三、溶液荧光的猝灭荧光物质分与溶剂分子或其它溶质分子的相互作用引起荧光强度降低的现象。猝灭剂：能引起荧光猝灭的物质。例：卤素离子、重金属离子、氧分子、硝基化合物、重氮化合物、羰基和羧基化合物。1.碰撞猝灭相对速率

1K1[M*]K2[M*][Q]与分子的直径、粘度、温度等因素有关。激发发射猝灭2.氧的猝灭作用氧分子是荧光、磷光的猝灭剂，没有除氧，溶液中难以观察到磷光3.自猝灭与自吸收当荧光物质的浓度大于1g/L时，常发生荧光的自猝灭(浓度猝灭)自吸收：由于

F<1，使荧光强度减弱或消失.形成二聚体：由于二聚体不发荧光，或发射荧光的能量有改变，造成自猝灭现象。第二节、分子荧光定量分析

荧光强度

F正比于吸收的光量Ia和荧光量子效率

：

F=K’Ia

由朗-比耳定律：Ia=I0(1-10-

bc)

F=K’I0(1-10-

bc)=K’I0(1-e-2.3

bc)浓度很低时，将括号项近似处理后：F=2.3

I0

lc

=Kc一.荧光强度(磷光)与浓度的关系三.分子荧光(磷光)强度与荧光物质浓度的关系1.荧光强度(磷光)与浓度的关系光吸收定律（Lambert–BeerLaw）相应的吸光分数为：荧光强度（IF）与相应的吸光分数成正比：按照级数展开式：对于稀溶液，当

bc<0.05（磷光

bc<0.01）时：F----荧光强度I0--入射光强度。F----磷光强度b--吸收光程

--摩尔吸光系数C--荧光物质浓度荧光强度与荧光物质的浓度成之正比.条件：极稀的溶液中，当

lc

0.05时才成立。较浓溶液，由于猝灭现象和自吸收等原因，使荧光强度和浓度不呈线性关系。

标准曲线法：

配制一系列标准浓度试样测定荧光强度，绘制标准曲线，再在相同条件下测量未知试样的荧光强度，在标准曲线上求出浓度；比较法：在线性范围内，测定标样和试样的荧光强度，比较；荧光猝灭法多组分混合物的荧光分析二.荧光分析定量方法第三节荧光光谱仪测量荧光的仪器主要由四个部分组成：激发光源、样品池、双单色器系统、检测器。特殊点：有两个单色器，光源与检测器通常成直角。基本流程如图：单色器：选择激发光波长的第一单色器和选择发射光(测量)波长的第二单色器；光源：氙灯和高压汞灯，染料激光器(可见与紫外区)样品池：石英检测器：光电倍增管。第四节荧光光谱法的特点及干扰因素一、荧光分析的特点（1）灵敏度高比紫外-可见分光光度法高2～4个数量级；为什么？检测下限：0.1～0.1g/cm-3

相对灵敏度：0.05mol/L奎宁硫酸氢盐的硫酸溶液。（2）选择性强既可依据特征发射光谱，又可根据特征吸收光谱；（3）试样量少缺点：应用范围小。二、荧光分析的干扰因素（1）温度（2）溶剂效应（3）pH值（4）内滤光和自吸（5）散射光的影响（6）荧光污染（1）温度：温度增加，荧光强度下降。

原因：因为随着温度的升高，增加分子间碰撞的几率，促进分子内能的转化和系间窜跃、粘度或“刚性”降低。为提高灵敏度，荧光计的液槽上配有低温装置；荧光测定时需使试样保持恒温。【例】：荧光素钠的乙醇溶液-80℃，荧光效率100％.温度每增加10℃，荧光效率约减少3％。

温度F色氨酸酪氨酸吲哚乙酸奎宁辐射跃迁的速率基本不随温度而改变，而非辐射跃迁的速率随温度升高而显著增大。因此，升高温度会使非辐射跃迁概率增大，荧光效率降低。（2）溶剂效应：同一种荧光物质在不同的溶剂中，其荧光光谱的形状和强度有显著不同。★一般溶剂效应：指的是溶剂的折射率和介电常数等的影响.波长随溶剂电常数的增大，荧光峰的波长越大，荧光效率增大。溶剂相对介电常数荧光峰

/nm荧光效率乙腈38.84100.064丙酮21.54050.055氯仿5.23980.041四氯化碳2.243900.002表8-羟基喹啉在不同溶剂中的荧光峰和荧光效率★特殊溶剂效应：荧光体和溶剂分子间的特殊化学作用，如氢键、静电作用、电荷转移等作用，从而改变荧光物质结构来增加或降低荧光强度。增大溶剂的极性，将使n

跃迁的能量增大，

跃迁的能量减小，而导致荧光增强，荧光峰红移。特殊溶剂效应>一般溶剂效应。注意：溶剂效应也有与上述现象相反的情况。溶剂的极性增强对激发态会产生更大的稳定作用，电子激态比基态具有更大的极性，结果使荧光波长红移，荧光强度增大（3）溶液的pH值：对有机荧光物质：具酸或碱性基团的有机物质，在不同pH值时，其结构可能发生变化，因而荧光强度将发生改变；【例】:大多数芳香族化合物具有酸或碱功能团，对pH的变化敏感。【例】：苯胺：弱的有机碱在碱性溶液pH7～12中以分子形式存在，蓝色强荧光在酸性pH<2或>13以离子形式存在，荧光弱。对无机荧光物质：pH值会影响其稳定性。NH2NH3+pH≈1有荧光pH≈13无荧光【例】：(4)内滤光和自吸：内滤光：当猝灭剂吸收光谱与荧光体的荧光光谱有重叠时，处于激发单重态的荧光体激发分子的能量就可能转移到猝灭剂分子上或者猝灭剂吸收了荧光体发射的荧光，使荧光猝灭，而猝灭剂被激发，这是俗称“内滤作用”。

【例】：在1μg·mL-1的色氨酸溶液中，如有K2Cr2O7存在，由于在色氨酸的激发和发射峰附近是重铬酸钾的两个吸收峰，吸收了色氨酸的激发能和色氨酸发射的荧光，使测得的色氨酸荧光降低荧光自吸：当荧光物质浓度较大时，可吸收自身的荧光发射荧光物质的荧光发射光谱的短波长一端与该物质的吸收光谱的长波长一端有重叠，在浓度较大时，一部分荧光发射被自身吸收，引起荧光强度降低。(5)散射光的影响散射：当一束平行光投射在液体样品时，大部分光线透过溶液，小部分光由于光子与物质分子相碰撞，使光子的运动方向发生改变而向不同角度散射。瑞利散射光容器表面的散射光丁达尔散射拉曼散射光选择适当的激发光，使荧光避开拉曼光40050060070080604020450360320640720波长（nm）F奎宁硫酸盐的荧光光谱中的各种类型散射0.04μg奎宁/mL、0.1N硫酸、激发320nm丁达尔瑞利散射水的拉曼光奎宁硫酸盐荧光峰二级瑞利散射和丁达尔散射二级拉曼光消除方法：减少狭缝宽度截止滤光法选用适当波长的激发光选用高分辨率的仪器对纯溶剂的拉曼峰进行测定，然后在荧光光谱中进行校正或差示光谱。蒽（5×10-9mol/L）在不同样品池中的荧光光谱普通池无荧光池（6）荧光污染（1）无机化合物的荧光分析直接荧光测定，以铀和稀土元素为主；无机化合物与某种试剂反应，利用荧光呈现或淬灭来测定。常用的有机荧光试剂：8-羟基喹啉、安息香、黄酮醇与有机试剂配合物后测量；可测量约60多种元素。铍、铝、硼、镓、硒、镁、稀土常采用荧光分析法；氟、硫、铁、银、钴、镍采用荧光熄灭法测定；铜、铍、铁、钴、锇及过氧化氢采用催化荧光法测定；铬、铌、铀、碲采用低温荧光法测定；铈、铕、锑、钒、铀采用固体荧光法测定第五节荧光光谱法在农业上的应用（2）有机化合物的荧光分析有机化合物：多环胺类、萘酚类、吲哚类、多环芳烃、氨基酸、蛋白质等。药物：吗啡、喹啉类、异喹啉类、麦角碱、麻黄碱、可卡因、鸦片碱、巴比妥类、阿托品、异烟肼、利血平、色胺、阿司匹林、青霉素、四环素等药物的分析（3）农副产品蛋白质、维生素、有害残留物等食品:

食品添加剂、维生素含量、甾体、抗生素、酶和辅酶等的分析例：维生素A、B1、B2、B6、B12、E、C、叶酸等。（a）萘

f=0.29；

em=310nm（b）蒽

f=0.46；

em=400nm多环芳烃是重要的环境污染物，可用荧光法测定。

ex=386nm,

em=430nm3，4-苯并芘强致癌物（4）基因研究及检测

遗传物质的脱氧核糖酸(DNA)，自身的荧光效率很低，一般条件下几乎检测不到DNA的荧光。因此，常选用某些荧光分子作为探针，通过探针标记分子的荧光变化来研究DNA与小分子及药物的作用机理，从而探讨致病原因及筛选和设计新的高效低毒药物