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DB36TechniquelyRulesforDiagnosisandDetectionofSesameBacterialW江西省质量技术监督局发布I 1 1 1 1 2 3 4本标准按照GB/T1.1-2009给本标准起草单位：江西省农业科学院植物保护研究所、江西生物科技职1芝麻细菌性青枯病诊断及检测技术规程本标准规定了芝麻细菌性青枯病（Sesamebacterialwilt）诊断及检测技术的术语和定义、症状诊断、病原菌形态学鉴定与致病性测定和病原细菌染色体上编码rRNA相对应的DNA序列，存在16S～23SrRNA基因区间的一段高度可变序列，该区域种间多态性丰富，而种内却非常保守，这4病原菌形态学鉴定与致病性测定4.1菌株分离与形态学鉴定4.1.1菌株分离采集典型的芝麻细菌性青枯病标本，剪取病健交界处病茎3cm～4cm，经75%酒精消毒、灭菌水冲洗后，剪去两头取中间段置于装有5ml～10ml无菌水的试管中静置5min左右至悬浮液变混浊，用接种环蘸2行光学显微镜下菌体的革兰氏染色、鞭毛染4.1.2形态学鉴定3mm。在2,3,5-氯化三苯基四氮唑（简称TZC，下同）选择性培养基上，28℃培养72h，产生的菌落呈不规则圆形，具流动性，中心呈红色至桔红色，边缘为白色，菌落直径24.2菌株致病性测定4.2.1接种体制备将形态学鉴定为青枯菌(R.solanacerum)的菌株于NA平板上培养活化48h后，配成1×108CFU/ml菌悬4.2.2接种期4.2.3接种方法在26℃~30℃温室保湿条件下，采用以下3种方法接种：——剪叶接种：选择完全展开的叶片，用灭菌剪刀蘸取菌液剪——针刺接种：用灭菌的小号注射器抽取菌液，在茎杆中部叶腋处针刺注射菌液，每株注射菌液——伤根灌菌液接种:用小铁铲从距茎基2cm～3cm处斜插入土，随后每株灌入菌液30ml。4.2.4结果调查5.1特异性引物合成5.3琼脂糖凝胶电泳取扩增样品5µl，加入1µl6倍上样缓冲液（6×loadingbuffer），混匀，点样于1.0%的琼脂糖凝胶（含0.05µl/mlEB或Goldview）上样孔中，用0.5×TBE缓冲液在5V/cm～8V/cm电压条件下电3对5.3获得的阳性克隆进行序列测定。将测定得到的各菌株16SrRNA序列、ITS序列与GenBank中核4A.1NA培养基牛肉浸膏3g，酵母浸膏1g，蛋白胨5g，葡萄糖或蔗糖10g，琼脂18g～20g，蒸馏水1000ml，pH7.4～7.6。高压湿热121℃灭菌2A.2TZC培养基配制200ml蒸馏水中。加热溶化后，装入250ml三角瓶中，每瓶装200ml。121℃高压湿热灭菌5B.1.116S引物序列分别为5′-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3′；5′-ACGGTTACCTTGTTACGACTT-3′B.1.2ITS引物序列为5′-AGTCGTAACAAGGTAGCCGT-3′；5′-GTGCCAAGGCATCCACC-3′。扩增片段大小为5916PCR

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