中西医结合免疫学-第二十二章-免疫学检测技术的基本原理

第二十二章免疫学检测技术的根本原理第一节体外抗原抗体结合反响的特点及影响因素〔一〕抗原抗体反响的特点1.高度特异性2.外表化学基团之间的可逆结合3.适宜的抗原抗体浓度和比例4.抗原抗体反响的两个阶段1.高度特异性抗原表位与抗体分子的超变区互补结合抗体检测抗原：抗伤寒杆菌的抗体：检测伤寒杆菌抗原检测抗体：乙肝病毒：检测乙肝病毒抗体

2.外表化学集团之间的可逆结合抗原抗体之间：非共价键结合结合不稳定，易受温度、酸碱度和离子强度的影响。3.适宜的抗原抗体浓度和比例抗原或抗体过剩，形成的IC复合物体积小，数量少，肉眼不可见；抗原抗体浓度和比例适当：IC复合物体积大，数量多，肉眼可见。4.抗原抗体反响的两个阶段第一阶段：数秒至数分，形成小的IC；第二阶段：数分、数小时至数日，形成较大IC复合物。〔二〕抗原抗体反响的影响因素1.电解质2.温度3.酸碱度1.电解质：离子强度在适当浓度的电解质中：抗原抗体易结合为肉眼可见的凝聚物或沉淀物。实验中常用0.85%的NaCl等离子溶液作稀释液。2.温度体温或稍高于体温37ºC是抗原抗体反响的最适温度。一般常使用反响在37ºC水浴或孵育箱中进行。3.酸碱度最适酸碱度：pH6-8第二节检测抗原和抗体的

体外实验〔体液免疫检测〕血清学试验：抗原和其相应的抗体在体外相遇可发生特异性结合，用的抗体〔或抗原〕检测未知的抗原〔或抗体〕，用于疾病的诊断。因为实验所采用的抗体常存在于血清或体液中〔关节液、脑脊液、胸水及腹水〕，将体外的抗原-抗体反响称为血清学反响。1.凝集反响2.沉淀反响3.免疫标记技术4.蛋白质芯片技术1.凝集反响细菌、细胞等颗粒性抗原或外表包被抗原的颗粒状物质与相应的抗体在电解质存在的条件下结合，出现肉眼可见的凝集团现象。〔1〕直接凝集反响〔2〕间接凝集反响〔1〕直接凝集反响：颗粒性抗原直接与相应的抗体反响出现的凝集现象，如红细胞的凝集〔ABO血型〕、细菌凝集。玻片法：定性，ABO血型、菌种鉴定试管法：半定量，检测Ab的效价〔2〕间接凝集反响：将可溶性抗原或抗体先吸附在某些颗粒载体上，然后与相应抗体或抗原进行反响产生的凝集现象。类风湿因子检测：人变性IgG〔抗原〕吸附于乳胶颗粒，检测待检血清中的RF。

2.沉淀反响：毒素、组织浸液及血清中的蛋白等可溶性抗原与相应抗体反响后，出现肉眼可见的沉淀物。液相：环状、絮状沉淀反响，比浊法〔检测血浆蛋白、IgG、M、A和补体〕半固相：单向、双向琼脂扩散、免疫电泳3.免疫标记技术：是将抗原抗体反响与标记技术相结合，检测抗原或抗体的一类试验方法。将的抗体或抗原标记上示踪物质，通过检测标记物间接测定抗体或抗原的量。常用标记物：酶、荧光素、放射性核素、胶体金、化学发光物等。定性、精确定量、定位

〔1〕免疫酶测定法：是一种用酶标记一抗或二抗检测特异性抗原或抗体的方法。常用标记酶：辣根过氧化物酶〔HRP〕，碱性磷酸酶(ALP)酶联免疫吸附试验(enzymelinkedimmunosorbentassay,ELISA)：

(1)双抗体夹心法(sandwichELISA)(2)间接ELISA免疫组织化学技术(immunohistochemistrytechnique):对组织抗原进行定位、定性、定量的检测技术。酶、化学发光、荧光技术。ELISA法将抗原和抗体的免疫反响和酶的催化反响相结合，具有特异性而且极为敏感，可以在细胞或亚细胞水平上检测抗原或抗体所在部位，或在微克、甚至纳克水平上对其进行定量。ELISA法是目前广泛应用于临床检测和生物制药等领域的免疫学技术，具有微量、特异、高效、经济、方便和平安等特点。结合物和相应的抗体或抗原反响后，结合在免疫复合物上的酶在遇到相应的底物时，可催化底物水解、氧化或复原，从而产生有色物质。因为颜色反响的深浅与相应的抗体或抗原量成正比，所以可以借助于颜色反响的深浅来定量抗体或抗原。ELISA

检测抗体

洗涤的目的是洗去反响液中没有与固相抗原或抗体结合的物质以及在反响过程中非特异性吸附于固相载体的干扰物质。(2)免疫荧光技术(immunofluorescencetechnique)

常用荧光素：异硫氰酸荧光素(FITC)

藻红蛋白(PE)1)直接荧光法

2)间接荧光法(3)放射免疫测定法(radioimmunoassay,RIA)(4)化学发光免疫技术(5)免疫胶体金技术(6)免疫印迹技术(Westernblotting)SDS通常采用不连续电泳系统，通过电荷效应，浓缩效应和分子筛效应，到达蛋白质高分辨率的别离效果。SDS：十二烷基硫酸钠，一种阴离子外表活性剂，可使蛋白质的氢键和疏水健翻开，与之形成蛋白质－SDS复合物。由于SDS带有负电荷，消除了不同蛋白质间原有的电荷差异，使蛋白质分子在凝胶中的迁移率主要取决于它的分子量。ChronicLymphocyticLeukemia增强免疫应答：肿瘤、病毒感染性疾病抗原进行反响产生的凝集现象。TIL细胞SDS：十二烷基硫酸钠，一种阴离子外表活性剂，可使蛋白质的氢键和疏水健翻开，与之形成蛋白质－SDS复合物。Crohn’s,RheumatoidArthritis藻红蛋白(PE)Vaccination细菌、细胞等颗粒性抗原或外表包被抗原的颗粒状物质与相应的抗体在电解质存在的条件下结合，出现肉眼可见的凝集团现象。诱导免疫耐受：AID、超敏反响、移植排斥J&J/EliLilly如：白喉抗毒素、破伤风抗毒素疫苗的主要保护机制—中和抗体疫苗的主要保护机制—中和抗体1〕形态计数法：T细胞受到有丝分裂原刺激，出现体积增大、细胞形态不规那么、胞质增多、细胞核松散并出现多个核仁等形态变化。4.蛋白质芯片技术快速、准确、高通量的检测技术第三节免疫细胞功能的检测〔细胞免疫检测〕一、免疫细胞的别离葡聚糖-泛影葡胺密度梯度离心法二、免疫细胞功能的测定1.T细胞功能测定2.B细胞功能测定(1)抗凝静脉血(2)加等量NS(4)密度梯度离心血浆分离液RBCPBMCPMN(3)混匀后，缓慢加于别离液上1.T细胞功能测定〔1〕T细胞增殖试验1〕形态计数法：T细胞受到有丝分裂原刺激，出现体积增大、细胞形态不规那么、胞质增多、细胞核松散并出现多个核仁等形态变化。2〕3H-TdR掺入法3〕MTT法淋巴细胞转化试验〔形态学示意图〕原理：人T细胞外表有PHA或ConA受体，T细胞在体外受PHA或ConA的刺激后能转化为体积较大、代谢旺盛、且能进行分裂的淋巴细胞，以此测定T细胞的功能。

PHA刺激48~72小时淋巴细胞增殖—3H-TdR掺入法原理：将单个核细胞中参加PHA共同培养，在终止培养前8~15小时参加氚标记的胸腺嘧啶核苷〔3H-TdR),经β-液体闪烁仪检测淋巴细胞DNA的3H-TdR掺入量，推测淋巴细胞增殖的程度。培养液3H-TdRPHA淋巴细胞全血分层液离心过滤测量放射性淋巴细胞增殖试验〔3H-TdR掺入法〕示意图MTT(四甲基偶氮唑盐〕法原理：在细胞培养终止前数小时参加MTT，活细胞内线粒体琥珀酸脱氢酶分解MTT产生蓝色甲攒〔Formazan)沉积于细胞内或细胞周围，形成甲攒的量与细胞增殖程度成正相关。E-玫瑰花结试验示意图〔2〕迟发型超敏反响(DTH)的检测常用于检测：病原微生物感染、免疫缺陷病和肿瘤患者的免疫功能测定。常用皮试制剂：结核菌素、念珠菌素等。2.B细胞功能测定〔1〕各类Ig的测定：单扩、试管法、比浊法、ELISA等；〔2〕抗体形成细胞测定：溶血空斑试验、ELISPOT法

可生产多价疫苗，同时预防多种病原体感染。减少鼠源成分，其免疫原性减弱，减少副作用。优点：模拟自然感染，一般只需接种一次。优点：可同时诱导体液免疫应答和细胞免疫应答Orthoclone-OKT®自动免疫被动免疫J&J/EliLilly结合不稳定，易受温度、酸碱度和离子强度的影响。MTT(四甲基偶氮唑盐〕法适宜的抗原抗体浓度和比例检测标记物间接测定抗体或抗原的量。ColorectalCancer长期持续表达是否诱导免疫耐受？Anti-CD20antibodies：Rituximab,Zevalin,Bexxar选用免疫原性强的病原体，经人工大量培养后，用理化方法灭活制成。酶联免疫斑点法

〔Enzyme-LinkedImmunospot,ELISPOT)是在ELISA的根底上建立的检测抗体生成细胞及细胞因子产生细胞的方法。CK抗体包被的反应板

CK抗原包被的反应板加入淋巴细胞加入酶标记二抗加入底物检测抗原特异性B细胞加入底物T细胞产生CK的检测加入淋巴细胞加入酶标的CK抗体3.细胞毒试验检测CTL、NK等细胞杀伤靶细胞活性的一种细胞学技术。(1)51Cr释放法(2)乳酸脱氢酶释放法(3)细胞染色法(4)凋亡细胞检测法：1〕形态学检测法2〕琼脂凝胶电泳3〕FACS(流式细胞术:FCM)4〕TUNEL法4.吞噬功能测定〔1〕中性粒细胞吞噬试验〔2〕巨噬细胞吞噬试验5.细胞因子的检测〔1〕生物活性检测法〔2〕免疫学检测法可生产多价疫苗，同时预防多种病原体感染。抗伤寒杆菌的抗体：检测伤寒杆菌E-玫瑰花结试验示意图结合物和相应的抗体或抗原反响后，结合在免疫复合物上的酶在遇到相应的底物时，可催化底物水解、氧化或复原，从而产生有色物质。第三节免疫细胞功能的检测〔细胞免疫检测〕二抗检测特异性抗原或抗体的方法。〔2〕抗体形成细胞测定：溶血空斑试验、BMS/ImCloneSystems(3)放射免疫测定法(radioimmunoassay,RIA)适宜的抗原抗体浓度和比例ELISA法是目前广泛应用于临床检测和生物制药等领域的免疫学技术，具有微量、特异、高效、经济、方便和平安等特点。1〕形态计数法：T细胞受到有丝分裂原刺激，出现体积增大、细胞形态不规那么、胞质增多、细胞核松散并出现多个核仁等形态变化。抗原进行反响产生的凝集现象。ViralRespiratoryDisease〔2〕巨噬细胞吞噬试验免疫学预防与治疗第二十三章根据免疫学原理，利用物理、化学和生物学的手段人为地增强或抑制机体的免疫功能，到达预防和治疗疾病目的的措施。免疫学防治免疫学防治Howtogetimmunitytothediseases?自然免疫主动被动人工免疫主动被动特异性免疫获得的方式自然免疫人工免疫自动免疫被动免疫显性感染隐性感染胎儿或新生儿从母体获得抗体主动免疫被动免疫注射疫苗注射抗体或细胞因子获得免疫的途径主动免疫〔Artificialactiveimmunity〕给机体输入抗原性物质，激活机体的免疫应答，使机体自身产生抵抗疾病的能力。被动免疫〔Artificialpassiveimmunity〕将对疾病有免疫力的供者的免疫应答产物转移给受者，或自体免疫细胞体外处理后回输自身，以预防或治疗疾病。自然主动免疫人工主动免疫自然被动免疫人工被动免疫第一节免疫预防疫苗概念：疫苗是利用微生物及其代谢产物，经过人工减毒或灭活或基因工程等方法制成，用于预防疾病的人工主动免疫制剂。疫苗疫苗的根本要求平安有效实用包括：细菌疫苗、病毒疫苗、原虫疫苗、避孕疫苗、肿瘤疫苗等。

疫苗的主要保护机制—中和抗体Th

B7MHC-IITCR

CD4

ICAMLFA-1APCThThBCD40LCD40分泌细胞因子ThBBB浆细胞BCR抗原Bm

CD28Vaccination疫苗的分类减毒活疫苗灭活疫苗类毒素疫苗亚单位疫苗DNA疫苗可食用疫苗减毒活疫苗是用减毒或无毒力的活病原微生物制成。卡介苗、口服小儿麻痹疫苗〔糖丸〕优点：模拟自然感染，一般只需接种一次。免疫原性强、免疫效果好缺点：可能出现毒力回复突变减毒活疫苗牛型结核杆菌

Mycobacteriumbovis置于含胆汁的培养基，逐渐增加胆汁的浓度卡介苗BacillusCalmette-Guerin〔BCG〕在胆汁中适应性生长，充分减毒成为预防肺结核的疫苗。13年230次传代法国科学家CalmetteGuerin灭活疫苗选用免疫原性强的病原体，经人工大量培养后，用理化方法灭活制成。又称“死疫苗〞。如：流感疫苗、甲肝疫苗优点：平安缺点：免疫原性较差，主要诱导特异性抗体的产生；需加强免疫。流感疫苗制备流程死疫苗和活疫苗的比较

区别点

灭活疫苗

减毒活疫苗制剂特点死、强毒株活、弱毒或无毒接种剂量及次数较多，2-3次较少，1次副作用较大较小保存及有效期易保存，较稳定易失效，4℃保存免疫效果较差，维持数月至2年较好，维持3-5年或更长类毒素疫苗类毒素是用细菌的外毒素经0.3~0.4%甲醛处理制成。如破伤风、百日咳、白喉类毒素疫苗亚单位疫苗提取或合成天然微生物某些成分的亚单位〔如外壳的特殊蛋白结构〕制成的疫苗。如：乙肝疫苗、HPV〔宫颈癌〕疫苗；细菌荚膜多糖疫苗等。

优点：副作用小、更为平安、稳定缺点：免疫原性低，需与佐剂合用。乙肝病毒〔HBsAg〕HPV病毒〔L1蛋白〕DNA疫苗的优缺点优点：可同时诱导体液免疫应答和细胞免疫应答制备工艺简单，生产本钱低，适于大批量生产。比传统疫苗平安。性质稳定，易于保存、运输。可生产多价疫苗，同时预防多种病原体感染。缺点：是否整合至宿主基因组,诱导癌变？长期持续表达是否诱导免疫耐受？是否产生抗DNA抗体？我国推行的儿童根底免疫程序

年龄

疫苗

年龄

疫苗出生时卡介苗、乙肝疫苗8个月麻疹疫苗2个月三价脊髓灰质炎疫苗11.5-2岁百白破43个月三价脊髓灰质炎疫苗2，百白破14岁三价脊髓灰质炎疫苗44个月三价脊髓灰质炎疫苗3，百白破27岁卡介苗、麻疹疫苗、白破二联疫苗5个月百白破312岁卡介苗（农村）新疫苗的3期临床试验I期：以新疫苗的的平安性为主；Ⅱ期：以新疫苗的有效性为主；Ⅲ期：证明新疫苗预防传染病的免疫保护性为主。疫苗的临床试验第二节免疫治疗抗体为根底的免疫治疗抗原为根底的免疫治疗细胞因子为根底的免疫治疗细胞为根底的免疫治疗DateofFDAApprovalⅢ期：证明新疫苗预防传染病的免疫保护性为主。Crohn’s,RheumatoidArthritis缺点：免疫原性低，需与佐剂合用。如：乙肝疫苗、HPV〔宫颈癌〕疫苗；检测标记物间接测定抗体或抗原的量。常用标记物：酶、荧光素、放射性核素、胶适宜的抗原抗体浓度和比例针对机体异常的免疫状态，人工给予抗原以增强免疫应答或诱导免疫耐受来治疗疾病血浆蛋白、IgG、M、A和补体〕毒性疾病的疗效原理：将单个核细胞中参加PHA共同培养，在终止培养前8~15小时参加氚标记的胸腺嘧啶核苷〔3H-TdR),经β-液体闪烁仪检测淋巴细胞DNA的3H-TdR掺入量，推测淋巴细胞增殖的程度。结合不稳定，易受温度、酸碱度和离子强度的影响。淋巴细胞增殖—3H-TdR掺入法卡介苗、口服小儿麻痹疫苗〔糖丸〕抗体为根底的免疫治疗抗毒素(antitoxin〕用细菌外毒素屡次免疫马后获得免疫马血清，血清中含有大量能中和该外毒素的IgG类抗体，经浓缩纯化获得抗毒素。如：白喉抗毒素、破伤风抗毒素用途：治疗、紧急预防人特异性免疫球蛋白来源：恢复期病人、含高效价特异性抗体的供血者接受类毒素和疫苗免疫者的血浆丙种球蛋白〔g-globulin〕胎盘丙种球蛋白、人血浆丙种球蛋白来源：健康人静脉血健康产妇胎盘血〔脐血〕用途：用于多种病毒性疾病的防治，治疗先天性丙种球蛋白缺乏症，可提高对某些严重细菌性和病毒性疾病的疗效单克隆抗体〔monoclonalantibody)H2003PsoriasisRaptiva™Genentech/XomaC1997Non-Hodgkin’sLymphomaRituxan®BiogenIdec/Genentech/RocheM2003Non-Hodgkin’sLymphomaBexxar®Corixa/GlaxoSmithKlineC2004ColorectalCancerErbitux™BMS/ImCloneSystemsH2003AsthmaXolair®Novartis/Genentech/TanoxPD2002RheumatoidArthritisHumira™Abbott/CATH2001ChronicLymphocyticLeukemiaCampath®Schering/ILEXOncologyH2000AcuteMyleoidLeukemiaMylotarg™WyethC1998AcuteTransplantRejectionSimulect®NovartisC1998Crohn’s,RheumatoidArthritisRemicade®J&JHH19982004BreastCancerColorectalCancerHerceptin®Avastin®Genentech/RocheH1998ViralRespiratoryDiseaseSynagis®MedImmune/AbbottH1997AcuteTransplantRejectionZenapax®PDLIM2002Non-Hodgkin’sLymphomaZevalin™BiogenIdecC1994AcuteCardiacConditionsReoPro®J&J/EliLillyM1986OrganTransplantRejectionOrthoclone-OKT®OrthoBiotechAntibodyType(2)DateofFDAApprovalIndicationsNameofProduct(1)CompanyName美国FDA批准生产用于临床治疗的单克隆抗体临床用单克隆抗体Anti-moleculeonthesafaceofcellsantibodyAnti-cytokinesmonoclonalantibodyMonoclonalantibodiescoupledwithtoxicagent.(抗体导向药物/免疫毒素)一、抗细胞外表分子抗体Anti-CD20antibodies：Rituximab,Zevalin,Bexxa