生物制药-基因工程

基因工程制药张忠山四、动物细胞中的基因导入和表达1974年，Jaenish和Mintz应用显微注射法，在世界上首次成功地获得了AV40DNA转基因小鼠。Palmiter等人于1982年将大鼠的生长激素基因导入小鼠受精卵的雄原核中，转基因动物技术轰动了整个生命科学界。

1、反转录病毒法构建利用反转录病毒可以转移小片段DNA（≤10kb）2、显微注射法构建3、胚胎干细胞法构建第四节基因工程菌

的不稳定性一、质粒不稳定产生的原因分裂不稳定：指工程菌分裂时出现一定比例不含质粒子代菌的现象。(常见)

结构不稳定：指外源基因从质粒上丢失或碱基重排、缺失所致工程菌性能的改变工程菌的质粒不稳定因素：一是含质粒菌产生不含质粒子代菌的频率；二是这两种菌的比生长速率差异的大小。对同一工程菌，通过控制不同的比生长速率可以改变质粒的拷贝数：含低拷贝质粒的工程菌产生不含质粒子代菌的频率较大，增加质粒拷贝数能提高质粒的稳定性；含高拷贝质粒的工程菌产生不含质粒子代菌的频率较低，但是大量外源质粒的存在使含质粒菌的工程菌的比生长速率明显低于不含质粒菌，而不含质粒菌一旦产生，能较快地取代含质粒菌而成为优势菌，对质粒的稳定性不利。质粒稳定性的分析方法（1）将工程菌培养液样品适当稀释，均匀涂于不含抗生素标记的平板培养基上，培养10-12小时，统计所长出的菌落数A；（2）然后随机挑选100个菌落，接种到含有抗生素标记的平板培养基上，培养10-12小时，统计所长出的菌落数B；（3）计算出B/A的比值。该比值能够反映出质粒的稳定性。因为丢失质粒的细菌在含的抗生素的培养基环境中是不能正常生长的。二、提高质粒稳定性的方法

1、分阶段培养法2、在培养基中加入抗生素，形成选择性压力3、通过温度、PH值、培养基组分、溶解氧的综合调节措施工程菌的培养一般分为2个阶段：

（1）第一阶段----先使菌体生长至一定密度。

（2）第二阶段----开始诱导外源基因的表达。由于第一阶段外源基因没有表达，减少了丢失质粒的细菌的产生概率，也就增加了工程菌的稳定性。因为丢失质粒的细菌在含的抗生素的培养基环境中是不能正常生长的。所以可以通过加入抗生素来抑制质粒丢失的细菌的生长。通过温度、PH值、培养基组分、溶解氧的综合调节措施通过以下方法可以提高质粒的稳定性。（1）间歇送氧（2）改变稀释速率第五节基因工程菌的

生长代谢特点1.基因工程菌的生长速率细菌菌体生长是核酸和蛋白质的综合表现，菌体生长对于提高质粒的稳定性、养活代谢副产物的积累、提高外源蛋白质的产量都有重要的意义。基因工程菌的生长速率可以通过选用不同的碳源、控制补料量、稀释速率的方法来加以控制。2、蛋白质产量/菌体数量比在基因工程菌的发酵生产过程中，蛋白质产量/菌体数量比基本上是一个恒定值。细菌生长速度快，其蛋白质合成的速度也相应加快。

3、能量供应与菌体生长的关系（1）、Andersen理论

Andersen等人通过实验认为，培养基中所能提供的最大能量决定着工程细菌的最大生长速率。当培养基提供的能量不足时，细菌往往会产生代谢副产物乙酸，而乙酸则会明显抑制细菌的生长。其实质是由于三羧酸循环的供能不足，导致部分乙酰辅酶A转化成乙酸来供能。（2）改进方法适当提高PH值，可以减少乙酸的抑制作用。分批培养中选用不同的碳源、控制补料速度、能在一定范围之内，控制细菌的过度生长，从而抑制乙酸的产生。4、小分子前体、催化剂供应与

菌体生长的关系（1）工程菌的生长速率往往低于未经克隆的原始宿主细胞（2）外源基因的大量表达常常引起工程菌的生长停滞。这种停滞与能量供应无关。（3）在基础培养基中加入氨基酸，能使细菌的生长速率提高。（4）当合成材料的前体物供应不足时，工程细菌就会产生“严紧反应”。当氨酰tRNA不足时，核糖体就会在密码子上停留，并合成ppGpp的魔点蛋白，这是一种调控因子，会导致RNA聚合酶在模板上移动的停顿。第六节基因工程菌中试1、工程菌的选择2、发酵器（发酵罐）设计3、发酵培养基组成4、工艺最佳化与参数监测控制5、计算机的应用第七节基因工程菌的培养1、基因工程菌培养的程序

①摇瓶操作----通过摇瓶操作，来了解工程菌生长的基础条件，如温度值、培养基的组分、氮碳比、表达产物的积累对于工程细胞的影响。

②培养罐操作----通过培养罐操作，来确定培养参数、确定培养方案、以及确定培养顺序。摇瓶培养

全自动动植物细胞培养发酵罐2、基因工程菌的培养方式（1）补料分批培养（2）连续培养（3）透析培养（4）固定化培养（1）补料分批培养是指将种子接入发酵反应器进行培养，经过一段时间之后，间歇式地、或者连续地补加新鲜培养基，使菌体进一步生长的方法。其目的是为了创造一个良好的微生物环境，延长菌体的对数生长期，来获得高密度的菌体总量。（2）连续培养将种子接入发酵反应器中，搅拌式培养达到一定的菌体浓度之后，同时进行进料、出料的操作，通过控制一定的营养物稀释比率，来进行不间断式培养的方式，称为连续培养。连续培养有利于保持生产环境的恒定，有利于控制菌体的生长速率。但是由于基因工程菌的不稳定性，导致连续培养比较困难。（3）透析培养透析培养是利用膜的半透性原理，使得代谢产物和培养基分开，通过去除培养液中的代谢产物的方法来消除代谢产物对工程菌的不良影响。透析装置是用半透膜将发酵器隔成二半，形成发酵液区和透析液区，通过透析来及时移去合成产物。半透膜的种类、孔径、面积、发酵液和透析液的比例、透析液的组成、循环流速、培养持续时间等等因素会影响产物的得率。用透析法培养大肠杆菌E.

coli—HB101（pPAKS2）生产青霉素酰化霉，其产率可以提高11倍。（4）固定化培养为了维持质粒的稳定性，人们将固定化技术和基因工程菌结合起来，进行固定化式连续培养，有利于提高生产效率。

3、影响基因工程菌培养的因素分析基因工程菌传统发酵工艺生物材料

含外源重组基因

不含外源重组基因发酵工艺使外源基因高效表达

使自身基因表达目的产生外源蛋白质

产生自身的代谢产物基因工程菌发酵与传统发酵工艺的区别（1）培养基的影响（2）接种量的影响（3）温度的影响（4）溶解氧的影响（5）诱导时机的影响（6）PH值的影响（1）培养基的影响①常用的碳源有：葡萄糖、甘油、甘露糖、果糖。

②常用的氮源有：酵母提取物、蛋白胨、酪蛋白水解物、玉米浆、制定水、硫酸铵、硝酸铵、氯化铵。

③其它组成成份：无机盐、微量元素、维生素、生物素。

④无机磷在许多初级代谢的酶促反应中是一个效应因子。（2）接种量的影响接种量是指所移入的种子液体量与培养液体量的比例，它的大小会影响发酵物的产量和发酵周期。

①接种量小，菌体生长延迟，不利于外源基因的表达。

②接种量适中，生产菌能够迅速占领整个培养环境，减少菌体污染的机会。

③接种量过大，菌体生长过快，代谢产物积累过多，反而会抑制后期菌体的生长。一般来说，10-15%的接种量，菌体的延迟期短、菌群迅速繁衍、很快进入对数生长期，适用于个源基因的表达。（3）温度的影响温度对基因表达的调控作用发生在复制、转录、翻译、小分子蛋白质的合成水平等方面。①在复制水平，温度可影响基因拷贝数量。②在转录水平，温度可影响RNA聚合酶的作用，而来调控基因表达。③在翻译水平上，还可以通过小分子蛋白质的合成水平来影响基因表达。④温度还影响蛋白质的活性和包含体的形成。温度影响的例子（1）大肠杆菌合成青霉素酰化酶，从37℃起随着温度的下降，青霉素酰化酶的合成产量逐渐增加，20℃--22℃时达到高峰，16℃以下，青霉素酰化酶的产量反而下降。这是由于在18℃--16℃时，工程菌生长减慢。实验证明，造成这种减慢的原因是由于温度影响了细胞内青霉素酰化酶mRNA的浓度。（2）分泌型人粒细胞—巨噬细胞集落刺激因子工程菌E.

coli—W3100/pGM-CSF，在30℃时，蛋白质表达量最高，37℃时，由于细菌的热休克系统被激活，其蛋白质表达量反而下降。（3）重组人生长激素工程菌，在30℃时的产物是可溶的，而在37℃所表达出的蛋白质则是不溶的。（4）溶解氧的影响溶解氧对于工程菌发酵过程中的菌体代谢是具有十分重要的作用。细菌在大量扩增过程中，要进行消耗氧气的生化反应过程。因此，维持较高水平的溶解氧水平（DO2≥40%），才能维持工程菌的快速生长和繁衍。分泌型人粒细胞—巨噬细胞集落刺激因子工程菌E.coli—W3100/pGM-CSF的发酵过程中，如果溶解氧≤20%，则产生大量杂蛋白。影响以后的纯化。必须维持溶解氧≥25%的水平。采用调整搅拌转速的方法，可以改善培养过程中的氧供给，提高活菌产量。（5）诱导时机的影响对于λPL—clts857突变株工程菌来说，在28℃-30℃培养时，这时突变体能产生阻遏蛋白、来阻止启动子的转译。而当温度上升到42℃时，这种阻遏作用就消失。在这里，温度对于工程菌的表达起着诱导作用。

一般来说，对于处在生长期后期的工程菌进行诱导，如菌体细胞密度在109个/ml时，通过升温诱导，可以达到蛋白质表达增产的效果。这在工业化生产中具有较大的潜力。（6）PH值的影响PH对于细胞的正常生长、外源蛋白的高效表达都有影响。

①细胞生长期的最佳PH范围是6.8--7.4。

②外源蛋白表达的最佳PH范围是6.0--6.5。在发酵过程中，细菌自身对PH值具有一定的调节能力。当PH值超出其调节能力的范围时，就会影响细菌的生长。发酵前期，PH值可控制在7.0，随着蛋白质的表达，PH值不断下降，当PH≤6.0时，则应及时开动碱泵，加入碱液。4、基因工程菌的培养设备（1）发酵罐的组成部件

①空气加入系统----去水去油的空气压缩机+气体流量计+空气无菌过滤器+溶解氧电极+溶解氧控制系统。

②PH调节系统----H电极+PH控制系统+酸碱补加装置。

③温度控制系统----热敏电极+温度控制系统+加热器+冷冻水浴冷却系统。④消沫装置

⑤取样装置

⑥旋转搅拌装置

⑦进料系统----培养基加入口。

⑧排出系统----气体排出+冷却水排出+废料排出。（2）发酵罐的要求

总体要求：（A）保证发酵环境条件恒定，（B）不影响其遗传特性，（C）不能引起所带质粒丢失。具体要求（A）提供菌体生长的最适条件，（B）培养过程不得污染，（C）保证纯菌培养，（D）培养及消毒过程中不得游离出异物，（E）不能干扰细菌的代谢活动。（F）发酵罐应当用不锈钢制成，表面光洁，没有灭菌死角。（G）任何接口必须用密封圈，不得存在泄漏，（H）为了避免基因工程菌在自然界扩散，培养液废物必须经过杀灭处理之后才能进行排放。以免基因污染。第八节高密度发酵高密度发酵工艺：又称高密度发酵技术，是在传统发酵技术上改进的发酵技术，它采用增加工程菌对数期的生长时间、相对缩短衰亡时间来提高菌体的发酵密度，极大地改进了发酵工艺，最终提高产物的比生产率(单位体积单位时间内产物的产量)，不仅可减少培养体积，强化下游分离提取，还可以缩短生产周期,减少设备投资从而降低生产成本，极大地提高了在市场上的竞争力。一、影响因素1、培养基的选择培养基分为天然、组合和半组合培养基3种。高密度发酵要获得高生物量和高浓度表达产物,一般使用的培养基为半组合培养基。培养基各组分的浓度和比例要恰当,过量的营养物质反而会抑制菌体的生长,特别是碳源和氮源的比例。2、接种量

接种量的大小直接影响发酵周期。接种量小(0.5%～4%)时,比生长速率大,对数生长期持续时间长;接种量大(>8%)时,细菌较快地达到了稳定期,持续生长时间短,自溶也较快,所以接种量一般选择在4%以下。3、溶氧浓度

溶解氧浓度对菌体的生长和产物生成的影响很大，溶解氧的浓度过高或过低都会影响细菌的代谢。在高密度发酵过程中提高溶氧量的方法主要有：增大搅拌转速；增加空气流量以增加溶氧量；通入纯氧来提高氧的传递水平；培养基中添加H2O2，利用宿主菌的过氧化氢酶分解产生O2；提高氧的分压。4、pH值

稳定的pH值是使菌体保持最佳生长状态的必要条件。在高密度发酵条件下,细胞产生大量的乙酸和CO2,可使pH值显著降低。所以发酵工程中必须及时调节pH值使之处于适宜的pH值范围内,避免pH值激烈变化对细胞生长和代谢造成的不利影响。通常用于控制pH值的酸碱有HCl、NaOH和氨水等,其中氨水常被使用,因为它还具有补充氮源的作用。5、培养温度培养温度是影响细菌生长和调控细胞代谢的重要因素。较高的温度有利于细菌的高密度发酵,低温培养能提高重组产物的表达量。一般大肠杆菌的最适生长温度是37℃,而质粒稳定温度和目标蛋白的诱导温度大多为30℃。对于采用温度调控基因表达或质粒复制的重组菌,发酵过程一般分为生长和表达两个阶段,在不同培养阶段采用不同的培养温度有利于提高细菌的生长密度和重组产物的表达量,并可缩短培养周期。但较高的温度会导致包涵体的形成,不利于后期的纯化处理;同时,也会因为升温而引起质粒的丢失,而减少重组蛋白量。6、诱导剂及诱导时间控制浓度较低时，外源蛋白的表达水平随着诱导剂浓度的升高而不断升高；当浓度超过一定限度时，就会影响菌体代谢及蛋白表达水平。诱导时间的选择也是影响外源蛋白表达的一个重要因素。一般控制在菌体的对数生长期或对数中后期。7、代谢副产物高密度发酵过程中,细菌代谢产物CO2的积累也会抑制外源蛋白的表达。因为CO2

对菌体具有直接的毒害作用,而且溶解于发酵液中也会导致pH值的下降。以葡萄糖为碳源的大肠杆菌的生长,常伴随着乙酸的分泌,进而影响细胞生长和蛋白表达。当葡萄糖加入量超过菌体生长和二氧化碳生产所需量或在缺氧的条件下便会产生大量的乙酸。二、实现高密度发酵方法主要有：(1)适宜宿主的选择；(2)重组蛋白积累位点(如可溶的胞内积累、胞内聚合积累、周质积累或胞外积累)的确定；(3)重组基因最大表达的分子策略；(4)细胞生长和生产环境的优化；(5)发酵条件的优化；(6)后处理过程的优化。

第九节基因工程药物的

分离纯化（一）工程细菌所表达出蛋白质的特点1、目的产物在初始物料中含量很低。2、初始产物的组成十分复杂。除了目的蛋白质之外，还含有残余细胞、代谢产物、残余培养基、各种无机盐。3、目的蛋白质的稳定性很差，容易失活、变性，对于温度、PH、金属离子、有机溶剂十分敏感和脆弱。4、目的蛋白质的种类繁多，存在着大小不同的片段。5、纯度不高、常常含有杂菌、热原等等物质。（二）分离纯化技术的重要性为了获得高纯度、可供药用有生物活性蛋白质，必须对基因工程药物进行一定的分离和纯化。1、分离----以大肠杆菌为宿主的基因工程药物多为胞内产物，分离提取这类产物时，需要经过细胞收集、细胞破碎、细胞碎片分离的过程。2、纯化----经过破碎和分离之后，目的产物仍然存在着大量的杂质，杂蛋白质、类似蛋白质的异构体，为了获得合格的目的产物，必须进行纯化操作。3、精制----非蛋白质类纯质在经过纯化操作之后，仍然无法除去，需要进行灭菌和精制操作。（三）建立分离纯化工艺的根据1、根据基因工程菌生产过程所可能产生的代谢物种类产物类似物、毒素、主要杂质来决定分离纯化方法。2、根据目和蛋白质的理化特征、生物学特征决定分离纯化方法。如密度、溶解度、稳定性、疏水性、扩散性、分配系数、吸附性能、亲和能力等等。3、根据产品质量的要求决定分离纯化方法，如纯度、生活性、产品剂型、稳定性、最大杂质允许量。（四）分离纯化技术的基本要求和工艺优化1、技术条件要尽量温和，试剂的选择应尽可能不使蛋白质发生变性，以保持目的蛋白质的生物活性。2、使用具有针对性的分离方法，能有效地将目的蛋白质迅速分离。3、两种技术之间要能够尽量匹配，尽可能减少工艺步骤。步骤越多、最终产物的得率就越低。耗损也就越大。4、分离纯化过程要快、耗时尽可能短。耗时越长、蛋白质的生物活性就越低。5、工艺方法要具有良好的稳定性和可以重复操作。6、工艺技术必须容易操作、对设备条件要求低、能够满足高生产率的要求。7、工艺条件要确保生产操作的安全性、不易燃易爆、无污染。（五）分离纯化的基本步骤1、步骤2、工艺1、步骤一般不应该超过4-5个步骤（1）细胞破碎（2）固液分离（3）浓缩（4）初步纯化（5）高度纯化（6）成品加工和灭菌

2、工艺（六）分离纯化的基本方法1、细胞收集----离心法。2、细胞破碎：

（1）机械破碎法----高压匀浆法、超声波破碎法、高速珠磨法、高压挤压法、

（2）非机械破碎法----酶溶法、化学渗透法、热处理法、渗透压冲击法。3、固液分离----离心法、膜过滤法、双水相分配萃取法。4、纯化色谱技术----离子交换色谱、疏水色谱、反相色谱、亲和色彩谱、凝胶过滤色谱、高压液相色谱。5除非蛋白质杂质技术----除DNA、除热原、除病毒。

下面针对不同的技术作讲解-----总共22种技术和方法。1、离心法超速离心机4~10万转高速离心机2~4万转普通离心机2万转以下2、机械破碎法这是常用的方法其优点是速度快、处理量大、不会带入其它化学物质。但是机械破碎法在处理过程中会产生热量、因此应该采取冷冻冷却措施，以防目的蛋白质失活。3、高压匀浆法在高压匀浆器中进行，利用高速碰撞和压力变化，导致细胞破碎。

4、超声波破碎法是进行小量细胞破碎的常规方法。用15—20kHz的超声波使细胞破碎。5、高速珠磨法在珠磨机中进行。采用玻璃小球、瓷球、石英砂等研磨剂快速搅拌研磨。6、高压挤压法使用X-press挤压机将冷冻至-25℃的细胞悬液，通过高压挤压，引起细胞内冰晶破裂而粉碎细胞。具有破碎率高、细胞粉碎程度低、目的蛋白质生物活性保持较好的优点。7、酶溶法利用生物酶将细胞膜溶解。常用的酶有溶菌酶、葡聚糖酶、蛋白酶、甘露糖酶、糖苷酶、肽链内切酶、壳多糖酶。利用酶处理细胞时，必须控制好温度、PH、以及酶的用量。8、脂溶法利用苯、甲苯、抗生素、表面活性剂SDS、吐温、金属络合剂EDTA、变性剂如脲、盐酸胍来改变细胞膜的通透性，使得目的蛋白质渗透出来。9、热处理法容易导致蛋白质变性10、渗透压冲击法容易导致蛋白质变性11、膜过滤法常用的膜过滤技术分为：

（A）微滤----用于分离细胞、细胞碎片、包含体、蛋白质沉淀物等固体颗粒。

（B）超滤----用于浓缩蛋白质、核心酸、多糖等大分子物质。

（C）反渗透----用于脱去抗生素、氨基酸等小分子中的水分。12、双水相分配萃取法双水相系统是由2种水溶性高聚物混合而成，或者由一种高聚物与无机盐水溶液混合而成。常用的有

（1）聚乙二醇—--葡聚糖系统、

（2）聚乙二醇—--无机盐糖系统。将细胞悬液与双水相系统混合，进行离心，（1）聚乙二醇为上相，内含目的蛋白质和其它蛋白质类似物。（2）葡聚糖为下相，内含细胞碎片、多糖和核酸。13、色谱技术优点是具有多种多样的分离机制、能够进行自动化控制。蛋白质色谱技术方法的设计通常是根据产物分子的物理、化学参数和生物学特性来决定。具体要素有：（A）等电点：决定离子交换的种类和条件。

（B）相对分子质量：用以选择不同孔径的交换材料，以及介质的分离分级范围。

（C）疏水性，决定产物分子与反相介质的结合程度。

（D）聚合性：决定聚合、解聚的双向程度。

（E）生物物异性：决定配基的亲和和谐。

（F）溶解性：决定分离体系和蛋白质的浓度。

（G）稳定性：决定分离体系所采用的温度以及流程时间。

（H）产物均一性：影响产物的回收率。14、离子交换色谱（IEC）其基本原理是通过带电荷的溶质分子，与离子交换剂中可以交换的离子成份进行交换，从而达到分离的目的。由于IEC的分辨率高、容量大、操作容易、已经成为多肽、蛋白质、核酸、许多发酵产物分离纯化的一种常用方法。离子交换剂是一类高分子材料，其功能基团是由固定在骨架上的带电基团+能移动的可交换离子组成，两者之间通过静电结合。可交换离子称为反离子。它可以与溶液中带同种电荷的物质进行交换，并且这种交换中可逆的，在一定条件下，交换的物质还可以被解析。从而达到分离物质的目的。（1）正吸附（2）负吸附（1）正吸附将目的产物离子化，然后被交换到介质上，杂质则由于不被吸附而从交换柱中流出。

正吸附的优点：所各到的产物纯度较高，同时还可起到浓缩作用。适用于处理产物浓度低、工作液量大的溶液。（2）负吸附将杂质离子化，然后被交换到介质上，目的产物由于不被吸附而从交换柱中流出。负吸附适用于处理目的产物浓度较高的工作液。其缺点是通常只能除去50-70%的杂质，所得产物纯度不高。15、反相色谱（RPC）是根据蛋白质疏水性的差异程度来进行分离纯化的方法。RPC交换剂分为非极性固定相+极性流动相，是利用工作液中的非极性基团与非极性固定相之间的正向结合力、工作液中的分子极性基团与极性流动相之间的反向排斥力。达到分离的目的。RPC常用的固定相为硅胶烷基结合相，流动相为低离子强度的酸性水溶液+乙腈、甲醇、异丙醇等有机溶剂。RPC的缺点是由于流动相中常常含有有机溶剂，结果会使蛋白质发生变性。16、疏水色谱（HIC）是根据蛋白质疏水性的差异程度来进行分离纯化的方法。利用蛋白质分子表面上的疏水区域（如丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸、苯丙氨酸等非极性氨基酸侧链），与介质的疏水基团（如苯基）互相作用，来进行分离。HIC交换剂的固定相为有机聚合物键合相，流动相为PH=6-8的盐水溶液，在高盐浓度时，蛋白质分子借助疏水基因而被吸附，随着盐浓度的降低，吸附作用减弱，目的蛋白质被逐步洗脱。HIC的优点是流动相为水溶液，蛋白质能够保持天然活性。17、亲和色谱（AC）是利用固定化配基，与目的蛋白质之间特异性的亲和力进行吸附，如抗菌素体与抗原、受体与激素、酶与低物之间的特异性作用、来达到分离的目的。AC中能够与产物进行可逆结合的物质称为配基、与配基结合的支撑物称载体物。AC的过程分为三步：

（1）配基+载体物，进行固定化，组成具有特异性的分离介质。

（2）吸附目的产物中的各种蛋白质，除去不被吸附的杂质部份。

（3）解吸附作用，将其中的目的蛋白质纯化出来。18、凝胶过滤色谱采用具有空隙大小相对一致的多孔性凝胶作为分离介质，工作液中的小分子能够进入凝胶孔内，在凝胶柱内部缓慢流动。而大分子则由于不能进入孔内而进行快速流动，利用这种差别来分离不同分子量的蛋白质。凝胶过滤色谱主要应用于2个方面：

（1）用于除去杂质，

（2）用于除去目的蛋白质的多聚体、和降解产物。19、高压液相色谱20、除DNADNA在PH≥4.0时呈阴离子，而目的蛋白质的等电点PH=6.0。因此可以用阴离子交换剂吸附除去DNA。21、除热原热原质主要是肠杆菌科所产生的细菌内毒素，在细菌细胞溶解量会释放出来。热原质的成份来源于细菌细胞壁，是粘多糖。其性质相当稳定，高压灭菌也无法使其失活。注射用药必须进行无热原质处理，然而，到目前为止，除去热原体是比较困难的，因为传统的去除热原体的方法不适用于蛋白质生物制剂，常常会导致目的蛋白质变性失活。具体方法有阴离子交换法、疏水层析法、半和层析法，正在摸索之中。22、除病毒蛋白质生物制剂中的病毒是由宿主细胞带入的，常常在治疗过程中对病人造成二重感染，必须彻底除去。除去病毒的方法有：

（1）色谱分离法可除去病毒，

（2）紫外线照射使可病毒失活。

（3）微孔滤膜过滤法，2