DB21T 2592.2-2016 鸡传染性疾病检测方法 第2部分：鸡传染性支气管炎病毒荧光RT-PCR 诊断技术　　

DB21DB21/T2592.2—2016鸡传染性疾病检测方法第2部分：鸡传染性支气管炎病毒荧光RT-PCR诊断技术DetectionmethodofchickeninfectiousdiseasePart2：DiagnostictechniqueoffluorescentRT-PCRforavianinfectiousbronchitisvirus辽宁省质量技术监督局发布 4 4 4 4 4 4 6 6 6 6 6 8 9本部分起草单位：辽宁省动物疫病预防控制中心、辽宁省动物本部分适用于禽类及其产品中鸡传染性支气件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用DEPC：焦炭酸二乙酯（diethypyrocarbonatRNA：核糖核酸（ribonucleicadNTP：脱氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleosidetRT-PCR：反转录-聚合酶链式反应(reversetranscription-polymerasechainreactTaq酶：TaqDNA聚合酶（TaqDNApolymerasCt值：每个反应管内的荧光信号量达到设定的阈值时所经历的循环数（Cyclethresh4仪器与器材4.2高速台式冷冻离心机（最大离心力124.8微量移液器（1000μL、5.1Trizol：RNA抽提试剂，外观为粉红色，分装至棕色瓶中，于4℃~8℃保存。5.475%乙醇：用无水乙醇和DE5.13引物：用于RT-PCR反应引物浓度为10μmol/表1鸡传染性支气管炎病毒荧光RT-PCR检测用引物离心管（1.5mL、15mL）经121℃±2℃高压灭菌15min；医用剪刀、镊子、组织样品研磨器经样品应置于特定样品保存液中进行保存。可采用PBS液（pH7.0～7.4,0.01mol/L）、0.85%生水或不含有血清的细胞培养液作为保存液（含青霉素2000IU/mL、链霉素2000IU/mL、制霉菌素1000IU/mL，BSA5mg/mL）。样品采集后应置于加冰的保温箱中-70℃保存。按照《兽医实验室生物安全技术管理规范》进行样品的生物安全若样品为鸡胚增殖病毒的尿囊液，可直接采用尿囊），每管加入750μLTrizol，分别加入被检样品、阳性对照和阴性对照各250离心15min。取与6.2.1中相同数量灭菌的1.5mL离心管，加入500μL异丙醇(4℃预冷)。取6.2.2清液约500μL转移至相应的管中，颠倒混匀，室温静置15m4℃12000g离心15min加入20μL经DEPC处理的水和2μLRNA酶抑制剂，轻柔混匀，溶解管壁上的RNA，冰上保存备用。提取的RNA应在2h内进行荧光RT-PCR扩增；于-70RNA酶抑制剂表3鸡传染性支气管炎病毒荧光RT-PCR检测PCR反应体系2)阳性对照的Ct值应≤28.0,并出3)如阴性对照和阳性条件不满足以上条件2）阳性称取磷酸氢二钠(Na2HPO4•12H2O)71.64g，先加适量去离子水溶解，最后定容至10称取磷酸二氢钠(NaH2PO4•2H20)31.21g，先加适量去离子水溶解，最后定容至1000mL，A.30.02mo