DB21T 2211.2-2013 养殖贝类种质检测规程 第2部分染色体组型分析

ICS65.150B51DB21DB21/T2211.2—2013养殖贝类种质检测规程第2部分：染色体组型分析ThedetectionproceduresofshellfishgermplasmPart2:karyotypeanalysis辽宁省质量技术监督局发布IDB21/T2211.2—2013DB21/T****《养殖贝类种质检测规程》分为两个部分：──第1部分：抽样方法；──第2部分：染色体组型分析。本部分为DB21/T****的第2部分。本标准是按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准由大连海洋大学提出。本标准由大连市质量技术监督局归口。本标准起草单位：大连海洋大学。本标准主要起草人：丁君、常亚青、张静、王轶南。本标准于2013年**月**日首次发布。1DB21/T2211.2—2013本部分规定了养殖贝类染色体组型分析的试剂、仪器和设备、玻片标本制备和组型分析。2术语和定义下列术语和定义适用于本部分：2.1胚胎细胞法取发育正常的养殖贝类原肠期胚胎或担轮幼虫，加入适量浓度的秋水仙素，使其胚胎细胞被阻抑在分裂中期而获得养殖贝类染色体中期分裂相的方法。2.2体细胞法取鲜活的养殖贝类的鳃组织浸泡在适当浓度的秋水仙素溶液中，使其体细胞被阻抑在分裂中期而获得养殖贝类染色体中期分裂相的方法。2.3臂比染色体的长臂长度与短臂长度之比。2.4次缢痕染色体上的缢缩部位。次缢痕的数量、位置和大小是染色体的重要形态特征。2.5随体位于染色体末端的圆形或圆柱形的染色体片段,通过次缢痕与染色体主要部分相连。随体是识别染色体的主要形态特征之一。3试剂、仪器、设备3.1试剂—卡诺固定液：甲醇与冰醋酸按3:1（v/v）的比例混匀，现用现配；—吉姆萨染液：1.5g吉姆萨粉末溶入50mL甘油中，置于60℃温箱3h后，加入50mL中性甲醇，棕色瓶中保存。3.2仪器、设备—超净工作台；—天平（精度0.00001g2DB21/T2211.2—2013—显微镜（带显微照像）；—游标卡尺（精度0.01mm—吸管、离心管、载玻片。4玻片标本制备4.1胚胎细胞法4.1.1取样吸管吸取发育正常的养殖贝类原肠期胚胎或担轮幼虫50个～100个，置于离心管中，加入50%灭菌海水配置的0.01%秋水仙素溶液，浸泡处理2h～3h。4.1.2低渗吸除秋水仙素溶液，加入0.075mol/L氯化钾溶液低渗40min～50min。4.1.3固定吸除氯化钾溶液，加入卡诺固定液5mL～8mL固定15min～20min。弃去固定液，加入新的卡诺固定液，重复固定4次后，置于冰箱冷冻室中(-l8℃)保存12h以上。4.1.4解离吸除上清液，在细胞悬液中加入50％的冰醋酸0.1mL～0.2mL，吸管吹打解离1min～2min。4.1.5滴片将干净的载玻片放置在50℃~60℃的灯箱上。吸取细胞悬液，在距载玻片10cm～15cm高处滴2滴~3滴于载玻片上；或吸取细胞悬液在45°倾斜的冰冻载玻片滴2滴～3滴，并轻轻吹动，使细胞铺散开。将滴有细胞的玻片斜放静置，自然干燥。4.1.6染色用磷酸盐缓冲液（pH=7.2）将吉姆萨溶液按9:1稀释，将干燥后的玻片标本在稀释后的吉姆萨溶液中扣染，染色0.5h～1h后，自来水冲去染液，空气干燥后用于组型分析。4.2体细胞法4.2.1取样解剖取活体养殖贝类的鳃丝5条～10条，灭菌海水冲洗干净后，剪刀剪碎置于离心管中，加入50%灭菌海水配置的0.04%秋水仙素溶液，浸泡处理0.5h～1h。4.2.2低渗吸除秋水仙素溶液，加入0.075mol/L氯化钾溶液低渗30min～60min。4.2.3固定，解离，滴片，染色分别按4.1.3～4.1.6规定执行。5组型分析3DB21/T2211.2—20135.1染色体数确定在油镜下选取50个～100个分散良好，形态清晰，着丝粒清楚，两条染色体单体适度分开的分裂相进行显微照像，冲印。计数染色体数目的众数，计算众数所占百分比，据此确定所检测养殖贝类的染色体数。5.2染色体相对长度计算游标卡尺测量照片上每条染色体的长度，根据公式：染色体相对长度=（每条染色体长度/单倍体组染色体总长度）×100%，计算染色体相对长度。5.3染色体分组和染色体组臂数计算5.3.1染色体分组游标卡尺测量照片上每条染色体的长臂和短臂长度，计算每条染色体的臂比，按臂比将染色体分为—臂比1.00～1.70，为中部着丝粒染色体m组；—臂比1.71～3.00，为亚中部着丝粒染色体sm组；—臂比3.01～7.00，为亚端部着丝粒染色体st组；—臂比7.01~∞,为端部着丝粒染色体t组。5.3.2染色体组臂数计算中部和亚中部着丝粒染色体的臂数计为2，亚端部和端部着丝粒染色体的臂数计为1。染色体组臂数为各染色体臂数的总和。5.4核型公式根据确定的养殖贝类的染色体数，染色体分组情况和染色体组臂数，列出所检测养殖贝类的核型公式。例如，某种贝类的核型公式：2n=38,18m+16sm+2st+2t,NF=72。5.5其他形态特征记录观测所检测养殖贝类染色体的其他形态特征，有无