cart细胞培养标准操作流程

cart细胞培养标准操作流程CAR-T细胞培养标准操作流程一、制定目的及范围为了确保CAR-T细胞的培养过程高效、规范，提升细胞产品的质量与安全性，特制定本标准操作流程。该流程涵盖了CAR-T细胞的培养、扩增及质量控制等环节，适用于科研机构、医院及细胞治疗中心等相关单位。二、培养原则培养CAR-T细胞需遵循以下原则：1.确保无菌操作，防止细胞污染。2.严格控制培养条件，包括温度、湿度、气体浓度等。3.细胞培养材料和试剂需符合相关标准，确保细胞生长和功能的最佳状态。4.进行定期的质量检测，确保细胞活力和功能。三、CAR-T细胞培养流程1.细胞准备1.1外周血单核细胞（PBMC）分离：从供体采集外周血，使用密度梯度离心法分离出PBMC。1.2细胞计数：使用细胞计数板或自动细胞计数仪进行细胞计数，记录细胞活力。1.3细胞冷冻储存：若不立即培养，可将PBMC进行冷冻保存，使用含有10%DMSO的冷冻保护液。2.转导步骤2.1病毒载体准备：根据需要选择合适的病毒载体进行生产，确保其浓度符合转导要求。2.2细胞转导：将PBMC与病毒载体混合，按照特定比例进行转导，通常在37℃、5%CO2的培养箱中培养24小时。2.3培养基更换：转导后，将培养基更换为含有相应细胞因子的完整培养基，如IL-2等。3.细胞扩增3.1细胞培养：在37℃、5%CO2的环境中培养细胞，保持培养基的适时更换，通常每2-3天更换一次。3.2细胞计数与分裂：每48小时进行一次细胞计数，确认细胞的增殖情况，必要时进行分裂，通常以1:2的比例进行分裂。3.3细胞活力检测：使用台盼蓝排斥实验或流式细胞仪检测细胞活力，确保细胞增殖效果良好。4.细胞质量控制4.1功能检测：对培养的CAR-T细胞进行功能检测，包括细胞毒性实验和细胞因子分泌检测。4.2表型分析：使用流式细胞仪检测CAR-T细胞表面标志物，确认转导效率及细胞亚群分布。4.3无菌检测：定期进行细胞培养的无菌检测，确保无污染发生。5.细胞收集与储存5.1细胞洗涤：当CAR-T细胞达到预期数量时，使用PBS缓冲液洗涤细胞，以去除培养基和细胞因子。5.2细胞重悬：将细胞重悬于适量的冷冻保护液中，通常使用10%DMSO与90%FBS的混合液。5.3冷冻保存：将重悬的细胞分装于冷冻管中，放入-80℃冰箱预冷，再转移至液氮罐中长期保存。四、记录与备案在整个操作过程中，需详细记录每一步的操作参数、细胞状态及质量检测结果。所有记录应归档保存，以备后续查询与审核。建立细胞培养档案，记录每批次细胞的来源、培养过程、功能检测结果及冷冻保存信息。五、人员培训与安全管理为确保CAR-T细胞培养的顺利进行，所有参与操作的人员需经过专业培训，了解细胞培养的基本知识和操作规范。操作过程中应遵循生物安全操作规程，佩戴适当的防护装备，防止生物材料泄露与交叉污染。六、流程优化与改进机制在实施过程中，定期对CAR-T细胞培养流程进行回顾和评估，根据技术发展、临床需求和实验室实际情况进行必要的调整和优化。建立反馈机制，鼓励操作人员提出改进意见，持续提升