微生物检验技术-细菌检验技术

细菌的人工培养一、无菌操作技术二、接种方法(一)接种针和接种环取细菌的用具。(二)无菌室提供无菌环境。二、无菌技术1.无菌室使用前的消毒：打开紫外灯照射30min-1小时，或用5%的石炭酸喷雾消毒。2.所用物品均应在使用前严格灭菌。使用时不得触摸、碰撞未经灭菌的物品。3.无菌的试管、瓶子打开后应在火焰上通过2-3次，尽快盖好，或尽量靠近火焰；管、瓶口切忌朝上暴露于空气下。4.接种环、针，每次使用前、后都要在火焰上烧灼灭菌。

5.进行培养基的分装、细菌接种都要在生物安全柜中进行，注意生物安全，防止污染。6.无菌吸管头上应塞有棉花，不用口吹或吸液体。7.实验室的所有感染性物品未经消毒灭菌不能拿出实验室，应经消毒处理。8.操作者要注意个人防护，穿好工作服，必要时戴好帽子、口罩、手套等，离开时要更衣、消毒、洗手。9.桌面、操作台需及时用消毒液擦干净。(三)接种与分离技术1.平板划线法：⑴分区划线法(二)连续划线法2.斜面接种法3.半固体接种法4.液体接种5.倾注法7涂布接种法三、细菌的培养方法1.普通培养法2.CO2培养法3.微需氧培养法4.厌氧培养法四、细菌的生长现象(一)菌落(二)细菌在液体中的生长现象1.均匀混浊2.沉淀生长3.表面生长(三)细菌在半固体中的生长现象沿穿刺线生长。穿刺线两侧云雾状混浊。细菌在液体培养基中的生长现象细菌在半固体培养基中的生长现象有动力现象无动力现象鉴定细菌的其它试验原理：A群链球菌对杆菌肽几乎全敏感，而其他链球菌则耐药。培养基：BAP方法：同纸片法药敏0.04U/片结果：＞10mm敏感；＜10mm耐药意义：A群链球菌敏感1.杆菌肽试验2.O/129试验原理：O/129（二氨基喋啶）对弧菌属有抑制作用，而对气单胞菌属无抑制作用培养基；碱性琼脂培养基方法：纸片法药敏40ug/片结果：有抑菌环为敏感，无抑菌环为耐药意义：弧菌、邻单胞菌敏感；气单胞菌属耐药3.奥普托欣(Optochin)试验原理：肺炎链球菌对Optochin敏感，其他链球菌无抑制作用培养基：BAP方法：同纸片法药敏5ug/片结果：抑菌环直径＞14mm敏感；＜14mm耐药，此时加做胆汁溶菌试验证实意义：肺炎链球菌对Optochin敏感4.新生霉素敏感试验原理：表皮葡萄球菌对新生霉素敏感；腐生葡萄球菌对新生霉素耐药培养基：MH琼脂方法：同纸片法药敏5ug/片结果：抑菌环直径＞16mm敏感；≤16mm耐药意义：区别表皮葡萄球菌与腐生葡萄球菌5.溶血试验某些细菌在代谢过程中能产生溶血素，可使人或动物的红细胞发生溶解，不同的细菌有不同的溶血反应，借此可鉴别细菌。（1）α（甲型）溶血:菌落周围出现较窄的半透明的草绿色溶血环。（2）β（乙型）溶血:

菌落周围出现较宽的透明溶血环。（3）γ（-丙型）溶血:

菌落周围无溶血环。甲型（α-）溶血乙型（β-）溶血丙型（γ-）溶血甲型溶血性链球菌（草绿色链球菌）丙型链球菌乙型溶血性链球菌6.胆汁溶菌酶试验原理：胆汁或胆盐可溶解肺炎链球菌，使细菌发生自溶试剂：10%去氧胆酸钠或纯牛胆汁方法：平板法：滴加10%去氧胆酸钠一环于被测菌落上35℃30min观察结果。试管法：0.9ml被测菌培养物加入10%去氧胆酸钠0.1ml后置35℃水浴10-30min观察结果

结果：菌落消失，或培养物变透明为阳性

意义：肺炎链球菌阳性7.氢氧化钾拉丝试验

(1)原理：G-细菌的细胞壁在稀碱溶液中易于破裂，释放出未断裂的DNA螺旋，菌悬液呈现粘性，可用接种环搅拌后拉出粘丝来.(2)方法：取1滴40g/L氢氧化钾水溶液（应新鲜配制）于洁净玻片上，取新鲜菌落少许与其搅拌混匀，观察能否拉出粘丝。(3)结果：拉出粘丝者为阳性。(4)应用：主要用于革兰阴性菌与易脱色的革兰阳性菌的鉴别。大多数革兰阴性菌于5-10s内出现阳性反应。反应慢者大多数菌株在60s内出现阳性，而革兰阳性菌在60s以后仍为阴性。

8.免疫学鉴定免疫学反应：指相应的抗原与抗体在体外一定条件下作用，所出现肉眼可见的沉淀、凝集现象。

9.毒力鉴定：内毒素、外毒素

一、内毒素测定：鲎试验法二、外毒素试验：动物实验10.分子生物学检测一、聚合酶链反应（polymerasechainreaction,PCR)

实验原理聚合酶链式反应(polymerasechainreaction,PCR)，是一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法，故又称为基因的体外扩增法。在待扩增的DNA片断两侧和与其两侧互补的两个寡核苷酸引物，经变性、退火和延伸若干个循环后，DNA扩增2n倍。

定义

两条来源不同，但具有互补序列的核酸，按碱基配对原则复性形成一个杂交体，这个过程即杂交，或称分子杂交。分类

DNA-DNA

DNA-RNA

RNA-RNA二、核酸杂交(Hybridization)三、生物芯片技术生物芯片（biochip）的概念指采用光导原位合成或微量点样等方法，将大量生物大分子如核酸片段、多肽分子甚至组织切片、细胞等生物样品有序地固化于支持物的表面，组成密集二维分子排列，然后与已标记的待测生物样品中的靶分子杂交，通过特定的仪器对杂交信号的强度进行快速、并行、高效地检测分析，从而判断样品中靶分子的数量。细菌形态学检查

一、实验室规则及注意事项不得在实验工作区内吃、喝以及装卸隐形眼镜等。实验用的冰箱中不得储存饮料、食物。在实验操作时请穿好实验防护衣及其它合适的防护服。实验室中不宜穿凉鞋、露趾鞋。操作感染性、有毒物质或动物时，必须戴手套。不宜将实验衣、手套或其它个人防护装备穿着到实验室以外的场所。实验工作台应每日清理，若有污染发生应立即进行消毒；所有设备在使用后均必须及时清理和处理，以保持无污染状态。所有污染物－玻璃器皿、动物笼、实验装置等，必须先经过消毒处理(如：高压蒸气灭菌或化学杀菌处理)，再行清洗或重复使用。废弃物需经适当之废弃物处理流程处置。在接触传染性物质、化学物质和动物后脱掉手套，切记洗手。严格无菌操作，树立良好无菌观念。在遇到不能处理的问题时，请立即与本实验室人员联系以便及时采取相应的处理或消毒措施。

显微镜的使用

微生物的基本特点：小！

决定了显微技术是进行微生物研究的另一项重要技术，因为绝大多数微生物的个体形态及其内部结构只能通过显微镜才能进行观察和研究。1.普通光学显微镜用油镜放大1000倍，一般细菌均能清楚看到。2.暗视野显微镜用于检查不染色的活细菌和螺旋体的形态及运动观察。3.相差显微镜4.荧光显微镜5.电子显微镜

细菌特殊染色负染色法细菌的基本形态和特殊结

构观察

细菌基本形态－球菌细菌基本形态－杆菌细菌基本形态－弧菌细菌特殊结构－芽胞细菌特殊结构－荚膜细菌特殊结构－鞭毛一、细菌染色标本的检查细菌标本经染色后，除能清楚看到细菌的形态、大小、排列方式外，还可根据染色反应将细菌进行分类。（一）染色方法的种类1、单染法:采用一种染料染色2、复染法（鉴别染色）:采用两种或两种以上的不同染料进行先后染色，使不同种类的细菌、同种细菌的不同结构，分别染上不同的颜色，以便鉴别细菌。（二）常用染料:苯环上带有色基和助色基，色基为颜色，助色基解离后与被染物结合。1.碱性染料：美蓝、结晶紫、碱性复红。2.酸性染料：伊红、酸性复红、刚果红。3.中性染料：碱性染料和酸性染料的复合物，伊红美蓝、伊红天青。（三）涂片制备涂片：干燥：固定：通常用火焰加热固定，将已干燥的涂片在火焰中迅速通过3次，以手背皮肤接触玻片不烫为佳。涂片干燥固定染色水洗、吸干镜检制备涂片标本→染色(一)单染色法只用一种染料将细菌染成一种颜色，只能观察细菌的形态、排列、大小。1.染液：吕氏美蓝液或稀释石炭酸复红液。2.方法：细菌涂片干燥固定，滴加染液染色1min，水洗，吸干，镜检。3.结果：菌体呈蓝色或红色。（二）革兰染色最经典、最常用的染色方法。通过革兰染色将所有细菌分为G+菌和G-菌两大类。革兰阴性菌（红色）革兰阳性菌（紫色）（三）抗酸染色法

抗酸染色结果（×1000）：红色为抗酸杆菌，蓝色为非抗酸杆菌抗酸染色用于区别抗酸菌与非抗酸菌（四）其他染色法

1.特殊结构染色法（1）荚膜染色法荚膜染色结果，×1000