埃博拉病毒+MERS采样与实验室检测

埃博拉出血热、MERS采样及

实验室检测技术病毒性出血热（VHF）的病原

主要为4个病毒科布尼亚病毒科黄病毒科沙粒病毒科丝状病毒科均为有包膜单链RNA病毒，动物或昆虫作为宿主和媒介丝状病毒不分节段的单负链RNA病毒，长微丝状，直径约100nm。长300～1500nm，平均970nm。具有长丝状、卷曲状、“U”型、“6”型等多型性。表面有刷子样排列的突起，长约10nm。基因组由19Kb核苷酸组成，编码NP、VP35、VP40、GP、VP30和L7种不同蛋白。表面突起由GP三聚体组成。source:/all_by_species/23.html埃搏拉病毒的型别扎伊尔型（Zaireebolavirus）苏丹型（Sudanebolavirus）

塔伊森林型（TaiForestebolavirus）雷斯顿型（Restonebolavirus）

本迪不焦型（Bundibugyoebolavirus）

51020150253035发病后天数抗原、核酸31667IgM抗体29102930168IgG抗体61819749死亡病例：出血征象，无尿，休克，呼吸急促，迟钝，意思障碍71611幸存者：肌痛，关节痛，乏力，肝炎，听力下降，眼部疾病，精神疾病6?早期症状：发热，寒战，头痛，肌痛，关节痛，乏力，腹痛，腹泻，咽痛，咳嗽，咽/结膜注射，皮疹埃博拉出血热临床表现与检测指标埃博拉出血热实验室检测内容（一）实验室检测

主要包括埃博拉病毒核酸和IgM、IgG抗体检测。（二）复核检测

1．具有开展埃博拉病毒检测资质的机构应将所有检测阳性和部分阴性的血清标本1mL送中国疾病预防控制中心病毒病所进行复核检测。

2.对检测阳性的标本进行病毒基因组序列分析。

3.检测阴性的疑似病例，应连续采集系列血标本进行病毒核酸、IgM、IgG抗体检测。实验室检测方法（一）病原学检测

1．核酸检测：为目前早期诊断、早期发现埃博拉出血热病例的主要检测方法：采用荧光定量PCR进行病毒核酸检测，患者标本中扩增到特异性核酸，可确诊埃博拉病毒感染。传统RT-PCR因易出现污染使用受限，但可以获得病毒基因序列。2.病毒抗原检测：用酶联免疫法检测埃博拉病毒核蛋白抗原。核蛋白抗原检测阳性可确诊。实验室检测方法（二）血清学检测

1.血清特异性IgM抗体：采用捕获法ELISA方法检测。疑似病例具有疫区旅行史或患者接触史，IgM抗体阳性，可确诊，阴性不排除埃博拉病毒感染。2.血清特异性IgG抗体：采用间接法ELISA或免疫荧光法检测IgG抗体。单份血清埃博拉病毒IgG抗体阳性为曾感染埃博拉病毒，双份血清埃博拉病毒IgG抗体阳转或恢复期滴度较急性期4倍或者以上增高者，可确诊，阴性不排除埃博拉病毒感染。检测对象（一）留观病例。（二）疑似病例。（三）确诊病例临床救治或出院前的患者。

样品采集人员：经生物安全防护培训，2人在场。器材：分离胶无菌真空促凝管。采集患者、疑似患者静脉血，每份3mL（根据采血管大小确定，每管采血量要少于常规采血量）。封口膜封闭管口，标记清楚，放入自封袋。4℃保存，填写样品采集登记表。包装、运输按照《病原微生物实验室生物安全管理条例》和《人间传染的病原微生物名录》规定，A类包装，符合UN2814，三重包装系统由第一层包装（螺口离心管），第二层安全容器（防水、防漏、抗跌）和外层运输包装组成。主容器放入防水防漏的第二层安全容器内，为降低破碎或泄漏的风险，用吸水纸等填充物固定主容器，第二层容器和外包装之间放冰袋或干冰。全血采用冷藏运输，血清可采用冷冻运输。运输前与接收单位生物安全负责人联系，办理相关手续，确定运输时间和方式，途中严禁打开采集管或分装样本。12标本容器第一层---主容器2mL,可离心带螺口带垫圈第二层---次级容器专用容器、15mL螺口管,封口膜封口，易标记13第二层也可用50mL离心管或专用次级容器专用次级容器第三层---外包装标本的接收和处理单位内指定部门接收样本，按既定程序转运至检测实验室。观察外包装，如无破损，可填写交接双联登记表，运至BSL-3实验室传递窗处打开外包装，将包装容器内的第二层包装取出，放在传递窗内，外包装留在传递窗外。进入进生物安全三级实验室缓冲间后，将第二层包装从传递窗取出，带入生物安全三级实验室核心区。在生物安全柜中，打开第二层包装，观察内层包装，核对标本单中患者的姓名、标本名称、标本编号、采样时间，详细记录标本的数量和体积。第二层包装盒喷洒消毒剂后置于医用垃圾袋内进行高压灭菌消毒处理。如外包装破损严重，则应喷洒0.5%（5000mg/L）有效氯的次氯酸钠消毒剂并在外包装增加一层塑料袋，转至BSL-3实验室30min后再打开，查看第二层包装。第二层包装或内包装破碎时应按照《感染性样品实验活动应急预案》处理，喷洒0.5%有效氯的次氯酸钠消毒剂消毒，并采取空间消毒，及时上报。标本的分装在生物安全柜中用止血钳缓慢打开标本内包装，全血标本需进行血清分离然后进行分装，血清标本可直接进行分装。每份不多于1mL装入带螺旋密封的2.0ml冻存管内，盖紧盖，管上标明编号、标本量，放入标本盒。做好记录（记录纸、笔、冻存盒不得进入生物安全柜中）。感染性标本要与灭活后标本分开保存，易于识别。分装标本所用的移液吸头及原标本空管应立即弃入含0.5%（5000mg/L）有效氯的次氯酸钠消毒液的防破碎的容器中，再放入垃圾桶内高压消毒处理。标本的灭活用于实验室检测所需的标本，在螺口盖盖好后，外表面用含0.5%有效氯的次氯酸钠溶液消毒，短暂离心，将标本管插入泡沫浮漂内，确保稳固插好后，用托盘将标本管移到水浴箱处，观察水浴箱水温是否达到60℃后，放入水浴箱，盖好箱盖，60℃1h进行灭活。对灭活的整个过程做好记录，包括：灭活标本的数量和体积、水浴箱的运行状态（尤其温度参数）、放入标本管的时间、取出标本管的时间、操作人及审核人等。标本灭活后，将标本管从水浴箱取出，擦拭表面，送入生物安全柜中，进行后期工作。剩余标本可弃入废弃物袋内，高压灭活。如需放入冰箱内保存，应标记清楚与未灭活的感染性物质保存于不同冰箱或抽屉，易于区别。严禁直接对真空采血管血样进行灭活。标本处理过程中可能存在的意外

处理血标本时，如血清分离、分装、灭活等过程中振荡混匀及离心过程中可能有气溶胶的产生、液体的溅出或滴洒。应事先在台面上铺防水纸垫，喷洒新鲜配制的含有0.5%有效氯的次氯酸钠溶液，移液时使用带滤芯的滴头，不能使用负压吸引器。

移液过程中，如血标本滴落在管壁、管口、生物安全柜台面，应及时喷洒含有0.5%有效氯的次氯酸钠溶液，再用75%酒精棉球进行擦拭。若手接触感染材料，用75%的酒精消毒后脱去最外层的手套，换一副新手套，并用75%的酒精纱布擦试管壁，将污染的纱布放在医用垃圾袋内，高压处理。

生物安全要求

1．凡涉及埃博拉病毒的未经培养的感染材料需在BSL-3实验室内进行分装、灭活等实验活动。核酸提取时，加入核酸提取裂解液后，可在BSL-2及以上实验室进行。任何血清学实验活动，均先60℃1小时灭活，灭活材料免疫学检测应在BSL-3实验室内进行。无国家生物安全委员会同意，严禁进行反向遗传等DNA重组实验。

2．在进行感染性材料操作时，如样本量≤1mL/份，每次操作标本不应超过12份；如果1mL/份<样本量≤5mL/份，每次操作标本不应超过6份；如果样本量＞5mL/份，每次标本操作不应超过3份。

个人防护个人衣、物、首饰等要去除，换上实验室专用工作服（手术服）；可遮盖全身的防护服、乳胶手套（双层）、医用口罩（N95）、帽子、护目镜、防渗漏防护服、高筒鞋套、防护面罩（正压头盔）等；注：手套、防护服大小要合适，检查有无破漏；手套的量要充足，满足随时更换。所有涉及感染性材料的操作均应在BSL-3实验室二级生物安全柜内进行；方便取用的消毒剂（0.5%次氯酸钠、75%酒精等），空间喷雾消毒物质（过氧乙酸，过氧化氢等）。Source:/csr/resources/who-ipc-guidance-ebolafinal-09082014.pdf?ua=1StepstoputonPersonalProtectiveEquipment(PPE)StepstoremovePersonalProtectiveEquipment(PPE)戴手套脱手套Source:GloveUseInformationLeaflet.WorldHealthOrganization,Geneva,2009.Availablefrom:/gpsc/5may/tools/training_educational/en/洗手---持续时间40-60sec核酸检测流程图反应体系混合物正、反向引物混合物特异性荧光探针1)核酸分离，BSL-32)Real-timePCR检测20

µl5µl反应条件取决于病原体特异性PCR仪合适的PCR管引物/探针序列引物探针1ZEBOV-FCGCCGAGTCTCACTGAATCTGZEBOV-RAGTTGGCAAATTTCTTCAAGATTGTZEBOV-PFAM-CGGCAAAGAGTCATCCCAGTGTATCAAGTAA-BHQ1引物探针2EBOGP1D-fwdTGGGCTGAAAAYTGCTACAATCEBOGP1D-revCTTTGTGMACATASCGGCACEBOGP1DZ-PrbFAM-CTACCAGCAGCGCCAGACGG-BHQ1体系：RNA模板5µl，酶（25x）1µl，缓冲液12.5µl，引物（10uM）各1µl，探针（10uM）0.5µl，加水至总体积25µl。推荐反应条件：50℃30min，95℃10min，95℃15s、60℃45s反应40个循环。结果判断：以定量荧光PCR反应的前3～15个循环的荧光信号作为本底信号，以本底信号标准差的10倍作为荧光阈值，标本扩增产生的荧光信号达到荧光阈值时所对应的循环数为循环阈值（Ct值），以Ct<35荧光信号数据线性化处理后对应循环数生成的曲线图成“S”形的标本，可判断为相应的埃博拉病毒核酸检测阳性。实时定量RT-PCR方法ZEBOVy=-3.469x+39.75

R2=0.999SEBOVy=-3.533x+38.41R2=1.000CEBOVy=-3.478x+38.87

R2=0.999ZEBOVy=-3.540x+39.69R2=1.000REBOVy=-3.509x+38.54R2=0.999BEBOVy=-3.470x+38.75R2=1.0002套实时定量PCR检测方法检出限50～100拷贝体外转录RNA参考品1套引物探针序列与目前西非流行株一致；1套采用兼并引物，与目前西非流行株差别2个碱基，但理论上不影响检测。引物序列大小方法1EBVGP451-472F5’-TGGGCTGAAAACTGCTACAATC-3’EBVGP1024-1003R5’-TTTTAGTTTCCCAGAAGGCCCA-3’570bp方法2Filo-A1ATCGGAATTTTTCTTTCTCATTFilo-B1ATGTGGTGGGTTATAATAATCACTGACATG414bpFilo-A2GTCAAAGCATTTCCTAGCAACATGATGGFilo-B2ATAATAATCACTCACATGCATATAACA282bp常规RT-PCR方法结果判断：阳性结果可以初步判断埃博拉病毒感染，但一般情况下需经序列分析确诊。

酶联免疫法检测埃博拉病毒核蛋白抗原、抗体BSL-3实验室60℃1小时灭活，样本量不超过0.5mL；

ELISA实验过程中可能存在标本灭活不彻底，出现感染性材料的滴洒或溅出，或在洗板过程中形成气溶胶。禁止采用手洗方式洗板，应在密闭的洗板机内进行。洗涤过程中，需用密闭戴盖容器盛装废液，并在实验前添加含10%有效氯的消毒剂，添加量要使废液瓶充满时有效氯浓度不低于0.5%。洗板量较大时，应使废液瓶有足够空间收集冲洗和消毒洗板机的废液，废液瓶满时，应停止洗板，作用30分钟后移至生物安全柜，倒入适合高压的废液瓶中，进行高压处理。

检测试剂尚未经实际临床标本评价，应结合流行病学资料，临床表现综合判断，阳性结果提示患者埃博拉病毒感染，用于埃博拉出血热早期诊断，阴性结果并不排除埃博拉病毒感染的可能。ZEBOV-NPSEBOV-NPCEBOV-NPREBOV-NPBEBOV-NP基于病毒核蛋白抗原的免疫学检测方法双抗体夹心ELISA检测抗原方法，检测限约低于10ng；基于核蛋白的IgM检测方法（MacELISA）；IgG抗体间接法ELISA检测方法。感染性血清标本的保存和销毁待检血清，60℃1小时水浴箱内灭活后，暂时保存于4℃冰箱；其他所有血清样本，在获得实验室检测结果之前，暂时保存BSL-3实验室内双人双锁的-70℃以下冰箱。

检测的阳性血清，在实验室主任批准后，转入高致病性微生物毒种库内保存，转运时需告知单位生物安全委员会主任。转运过程中，需实验室管理处和保卫处人员在场。标本出BSL-3实验室时，必须使用含0.5%有效氯的次氯酸钠的消毒剂擦拭冻存盒的外层，擦拭后应确保标记清楚，在传递窗中放入运输箱内，箱内铺垫有含0.5%有效氯的次氯酸钠的消毒剂的吸水物质，传出生物安全三级实验室工作区，再转入所高危病毒毒种库内保存。感染性血清标本的保存和销毁感染性样品的保存实行“双人双锁”管理和取样“审批”制度。储存样品的冰箱为“双人双锁”，钥匙分别由两人保存，只有实验室负责人和所生物安全委员会主任双审批同意后，在单位保卫处人员在场的情况下，由两人打开冰箱取样。任何人不能单独取走样品。实验室样品保管员负责对样品的状况、数量进行记录，负责定期检查样品保存状况。涉及埃博拉病毒感染性样品的实验活动实行“审批”制度，须填写书面申请，经实验室主任批准，报单位生物安全委员会同意批准后方可使用，并进行详细记录。任何人未经实验室主任和生物安全委员会批准，不得私自开展相关实验活动。感染性血清标本的保存和销毁实验室检测埃博拉病毒阴性血清，应在2个月后，所采集血清的疑似患者或密切接触者完全排除埃博拉病毒感染后，实验室主任可决定该血清样本转入其他血清库保存冰箱或销毁。所有血清销毁时，均应在冰箱内取出后，至于BSL-3实验室生物安全柜内，待其自然融化后，置于含有0.5%有效氯消毒剂的塑料袋或桶内进行高压灭活。所有销毁血清均应在相应数据库清单内标明血清销毁的时间和操作人，阴性血清销毁记录保存1年以后可以清除，阳性血清的销毁记录应保存5年以上。中东呼吸综合征冠状病毒（MERS-CoV）CoV(1937年)HCoV-229E(1965年)HCoV-OC43(1966年)SARS-CoV(2003年)HCoV-NL63(2004年)HCoV-HKU(2005年)MERS-HCoV(2012年)

病毒直径60-220nm，核酸不分节段单链（+）RNA，27-31kb。病毒粒子外脂肪膜，膜表面有三种糖蛋白：刺突糖蛋白（S，SpikeProtein），受体结合位点、溶细胞作用和主要抗原位点；小包膜糖蛋白（E，EnvelopeProtein），较小，与包膜结合的蛋白；膜糖蛋白（M，MembraneProtein，）负责营养物质的跨膜运输、新生病毒出芽释放与病毒外包膜的形成。少