分子医学实验 实验五 层析技术学习课件

实验五层析技术

孙启明

2014-10-22层析法的定义和基本原理

定义：层析法又称色谱法（Chromatography），是广泛应用的一种生物化学技术，层析法是利用混合物各组分物理化学性质（如溶解度、吸附能力、电荷和分子量等）的差别，使各组分在支持物上集中分布在不同区域；借此将各组分分离。

原理：层析利用两个相，一个相称为固定相；另一个相称为流动相。由于各组分受固定相的阻力和受流动相的推力影响不同，各组分移动速度各异，从而使各组得到分离。层析法的分类分类：层析法有多种类型，液体作为流动相的称为液相层析，气体作为流动相称为气相层析。1．按两相所处的状态分类：色谱中有两相，即流动相和固定相。流动相可以是气体或液体，固定相可分为固体吸附剂和涂在固体担体或毛细管内壁上的液体固定相。（1）气相色谱法：用气体作流动相的色谱法。再按固定相的状态，气相色谱又可分为气固色谱和气液色谱（2）液相色谱法：用液体作流动相的色谱法。再按固定相的状态，液相色谱亦可分为液固色谱和液液色谱2．按固定相的使用形式分类：可分为柱层析、纸层析和薄层层析。纸层析和薄层层析属于平面层析。（1）柱层析：固定相装在玻璃管或金属管内，或涂在柱内壁上。又分为填充柱色谱和空心毛细管色谱。层析时在柱顶部加入要分离的样品溶液，假如样品内含两种成分A与B，样品溶液全部流入吸附柱之后，加入合适的溶剂洗脱，A与B也就随着溶剂向下流动而移动，最后达到分离。连续分段收集洗脱液，各成分即可顺序洗出。（2）纸层析：用滤纸作载体，吸附在滤纸上的水为固定相,溶剂为液相，试样溶液在纸上进行展开、分离。（3）薄层层析：将固定相(吸附剂粉末)均匀地涂铺在玻璃板上或塑料板上，样品的展开、分离在其上进行。薄层层析法是将吸附剂在玻璃板上或其它薄膜上均匀地铺成薄层，把要分析的样品加到薄层上，然后用合适的溶剂展开，而达到分离鉴定的目的。优点是设备简单，操作容易，层析展开时间短，分离效率高，并可采用腐蚀性显色剂，而且可以在高温下显色。3．按层析过程的机理不同，层析法可以分为下列几种类型：①吸附层析②分配层析③离子交换层析④凝胶层析⑤亲和层析。实验内容（1）纸层析－转氨基作用的验证（2）薄层层析－脂类的分离（3）离子交换层析－混合氨基酸分离凝胶层析（4）血红蛋白和DNP－鱼精蛋白分离（不要求）纸层析法－转氨基作用验证【基本原理】体内α-氨基酸的α-氨基在氨基转移酶的作用下，移换至α-酮酸的过程，称氨基移换作用。此类酶各有一定的特异性，普遍存在于动物各组织中。本实验是将谷氨酸与丙酮酸在肝匀浆中的谷氨酸-丙酮酸氨基转移酶(简称谷-丙转氨酶)的作用下进行氨基移换反应，然后用纸层析法检查反应体系中丙氨酸的生成。其反应过程如下：转氨基作用由于谷氨酸、丙酮酸在肝匀浆中可循其他代谢途径分解和转化，影响氨基移换过程的观察，因此在反应体系中添加一碘醋酸(或一溴醋酸)以抑制谷氨酸和丙酮酸的其他代谢过程。【纸层析法－转氨基作用验证操作步骤】

一、肝匀浆的制备取小白鼠1只，颈椎脱臼法处死后，取出肝脏，经0.9%NaCl溶液洗去血污后，称取肝脏约1g，置研钵中加入玻璃砂少许(或用玻璃匀浆器研磨)，然后加0.01mol/L，pH=7.4磷酸缓冲溶液1ml磨成匀浆，之后再加入4ml磷酸缓冲液。二、转氨酶反应1．取短玻璃管2只编号(1、2)，各加肝匀浆10滴，先将2号管置沸水浴中5分钟（酶灭活对照管）。2．两管各加1%谷氨酸钾溶液10滴，1%丙酮酸钠溶液10滴，0.25%一碘醋酸钾溶液5滴，同置40℃水浴中保温30分钟。3．取出，向两管各加5%HAc溶液2滴，再同置沸水浴中5分钟，冷却后各取0.5ml反应溶液离心(2000r/min，5min)，将上清液移入另外同样编号的塑料离心管中备用。三、层析验证1．在10cm×20cm滤纸上，距短边2.5cm处用铅笔轻轻画一线(原线)，在原线上，每隔1.5cm处用铅笔作记号，并在线下底边注明1、2、谷氨酸、丙氨酸记号。2．用毛细管分别吸取1号液、2号液在层析滤纸上点样，注意斑点不可太大，一般直径约0.3cm为宜，约5min等干后，在1、2号原点上，再重复点两次次(注意，不可调错)，然后分别点上谷氨酸、丙氨酸，作为对照，干后置层析缸中展开1.5～2h。注意：点样处切勿浸入展开剂中。3．取出滤纸晾干，喷以0.1%茚三酮乙醇溶液，电吹风吹干，观察层析出现的斑点并解释之。12GluAla纸上层可折叠一下以便悬挂2.5cm点样处勿浸入展开剂中玻璃缸上沿挂绳，折叠滤纸挂在绳上，不同小组滤纸不要有接触薄层层析分离脂类【基本原理】薄层层析法是将固定相支持物均匀地铺在玻璃板上成为薄层，然后将要分析的样品点加到薄层上，用合适的溶剂展开而达到分离的目的。常用的固相支持物有硅胶、氧化铝、硅藻土、氢氧化钙、磷酸钙等；本实验以硅胶G作固定相。脂类硅胶薄层层析的基本原理主要是通过硅胶对不同的脂类物质具有不同的吸附能力。在展开剂（移动相）展开过程中脂类物质在两相之间重复进行吸附-解吸-再吸附-再解吸,使各种脂类物质随展开剂移行，结果，与固定相（硅胶）吸附能力弱的和/或在移动相中溶解度大的脂类物质随展开剂移行到较远的距离，而与固定相吸附能力强的和/或在移动相中溶解度小的脂类物质，在展开过程中移行慢，落在后面，这样展开一段时间后就可以将各种脂类物质彼此分离开来。薄层层析的优点是设备简单易行、展开时间短、分离迅速、样品用量小、灵敏度高、分离时几乎不受温度的影响，甚至不受腐蚀性显色剂影响，可以在高温下显色，分离效率高。薄层层析是一项常用的分离、鉴定脂类的技术。在脂类薄层层析中通常用硅胶G作为支持剂，可选用石油醚、四氯化碳、氯仿等作为展开剂。本实验用石油醚-丁酮-乙酸混合溶剂作展开剂。【薄层层析分离脂类操作步骤】1．层析薄板的制作：称取硅胶G2g置研钵中加入0.3%羧甲基纤维素8mL，研匀后迅速倒在8cm×12cm玻片上，水平放置，可用杵稍加涂抹使硅胶在玻璃上分布均匀，放置到硅胶凝固后，置100℃烘箱中烘干备用（放到实验台里面,平放,防止打翻或碰坏）。2．点样：分别用毛细玻管吸取各种脂质的标准液（3种）及试样（2种），在薄板的一端1.5cm高度处取间距为1cm点样三次，待溶剂蒸发后置于盛有展开剂的标本缸中，点样一端起点以下，浸入展开剂中。注意：点样处切勿浸入展开剂中。3．显色：约半小时后，当展开剂上升至适当高度（接近薄板上端，不要跑完薄板），将薄板取出电吹风吹干，喷以磷钼酸显色剂，再次吹干。比较各种脂质和试样所显斑点位置，作图记录之，计算Rf值，即斑点中心至原点的距离（cm）／展开剂扩展前沿至原点的距离（cm）。可在玻璃板背后划线标记点样处，不要在硅胶上划线破坏硅胶层1.5cm离子交换层析分离混合氨基酸【基本原理】离子交换层析是利用离子交换剂上的可交换离子与周围介质中被分离的各种离子间的亲和力的不同，经过交换平衡达到分离目的的一种柱层析法。氨基酸是两性电解质，每一种氨基酸都有它特定的等电点，各种氨基酸在pH小于其等电点的溶液中以阳离子的形式存在，可以与阳离子交换剂进行交换，再慢慢增大洗脱液的pH，氨基酸将依照其等电点由小到大的顺序逐渐洗脱，此时分部收集各洗脱组分，即可将各种氨基酸一一分离。本实验以天冬氨酸和精氨酸为例，利用磺酸型阳离子交换树脂将其从混合物中分离。天冬氨酸是酸性氨基酸，pI=2.98；精氨酸是碱性氨基酸，pI=10.76。根据其等电点，我们选择0.1M柠檬酸缓冲液（pH2.2），将它们都吸附在阳离子交换剂上，再用0.1M柠檬酸缓冲液（pH5.0）洗脱天冬氨酸，用0.1MNaOH溶液洗脱精氨酸。离子交换层析的基本原理示意图++++———++++++++++—+++【操作步骤】1．装柱：取加入填料的层析柱一支，夹好“再”形夹，用铁丝将树脂悬液搅匀，使树脂内不残留气泡，树脂自由沉降后打开“再”形夹，缓慢放出液体，当液面慢慢降至树脂面时，关闭下端“再”形夹。（注意在整个操作过程中，应防止液面低于树脂面，当液面低于树脂面时，空气进入树脂内形成气泡)2.洗柱：用0.1M，pH2.2柠檬酸缓冲液2ml洗柱，同时调整流速为5滴/min（20滴为1ml）3.加样：将混合氨基酸溶液0.2ml沿层析柱内壁缓缓加入，打开“再”形夹，使样品液缓缓流进柱床，流速为5滴/min。样品全部进入柱床后，用0.1M，pH2.2柠檬酸缓冲液2ml，分两次先后加入洗柱。4．洗脱及分段收集：用0.1M，pH5.0柠檬酸缓冲液洗脱，边加洗脱液边收集，并调节流速至10滴/min，每管收集1ml。所有收集管分次用茚三酮反应检测氨基酸。5．显色：待第一个氨基酸被洗脱后，（茚三酮反应检测连续两管呈阴性），立即改用0.1MNaOH以同样流速及收集体积洗脱，并对各管收集液进行氨基酸检测。1ml洗脱液+0.2%茚三酮溶液1ml+0.5M，pH5.0柠檬酸缓冲液1ml水浴中10min，溶液显兰紫色者为氨基酸阳性反应混匀1ml洗脱液+酸性茚三酮溶液1ml+0.5M，pH5.0柠檬酸缓冲液1ml水浴中10min，溶液显兰紫色者为氨基酸阳性反应混匀注意要点纸层析及薄层层析离心前用天平平衡两根试管点样三次，毛细管末端如果有破裂点样会有困难

点样处勿进入展开剂中不同组的层析板或纸不要有接触展开剂及显色剂不要弄混！！离子交换层析先检查连接柱子的橡皮管是否有粘连树脂内不要留有气泡树脂上层液面要高于树脂避免气泡进入茚三酮反应检测连续两管呈阴性才为洗脱干净清洗小试管两支，大试管三十支凝胶层析法分离血红蛋白和DNP－鱼精蛋白

【基本原理】凝胶层析法是利用凝胶把分子大小不同的物质分离开的一种方法。血红蛋白的分子量为67，000；鱼精蛋白的分子量为1，000–5，000，利用凝胶层析法可以将它们从混合物中分离开。根据被分离物质分子量，我们选择的凝胶是SephadexG–50，它的分子量适用范围为1，500～30，000。所以，血红蛋白不能进入凝胶内部，随洗脱液直接流出，鱼精蛋白分子量较小，可以进入凝胶内部，它的流经途径较长，较后流出层析柱。血红蛋白本身有红色，鱼精蛋白无色，故将黄色的DNP（2，4–二硝基氟苯）偶联于鱼精蛋白，使其着色，便于观察。【操作步骤】

1．样品制备临上样前，将0.3ml血红蛋白溶液和0.5mlDNP–鱼精蛋白溶液混匀即可。2．加样与洗脱切断洗脱液，当层析柱中液面下降与凝胶表层平齐时，即用滴管将样品液缓缓沿柱壁加入，不使凝胶表层扰动，待样品液面与凝胶表层平齐时，再加少许蒸馏水，并连通洗脱液，开始洗脱。注意观察